推荐一篇发表在Angew. Chem.上的文章，题目为“Next-Generation Metabolic Glycosylation Reporters Enable Detection of Protein O-GlcNAcylation in Living Cells without S-Glyco Modification”，通讯作者是来自德国康斯坦茨大学的Valentin Wittmann教授，主要研究方向为糖标记方法的开发、糖与蛋白质的相互作用以及生物正交反应。
O-GlyNAc糖基化修饰是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰，在生命过程中发挥着重要的作用。用含有各种报告基团的乙酰化保护的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)衍生物对活细胞的蛋白糖基化修饰进行代谢型标记是一种经典的O-GlyNAc糖基化修饰鉴定方法，然而，最近一些研究指出，乙酰化保护的N-乙酰氨基葡萄糖可以以非酶催化的方式直接和蛋白质的半胱氨酸反应，导致非特异性的S-Glyco蛋白质标记，使实验出现假阳性结果。使用非保护的GlcNAc可以一定程度上避免这个问题，但非保护GlcNAc的细胞膜渗透性很差。基于此，作者报道了一种降冰片烯修饰的GlcNAc衍生物，其异头碳位置修饰了一个带保护的磷酸，在进入细胞后，磷酸的保护基团可以被非特异性酯酶切割，然后进一步被UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(AGX)转化成UDP-GlcNAc。与传统的乙酰化GlcNAc相比，该衍生物在进行糖代谢标记的过程中减少了两个酶催化反应步骤，更重要的是，它可以免受S-Glyco非特异性修饰的影响，并且可以在活细胞内通过IEDDA反应，实现活细胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰检测。作者首先将构建的带不同磷酸根保护基团的几种糖探针与Hela S3细胞裂解液孵育，并观察到只有全乙酰保护的降冰片烯糖探针Ac4GlcNNorboc产生了标记信号，而修饰了带保护磷酸的几种探针则都没有产生标记，这表明他们不会受到非特异性蛋白标记的影响。接下来，作者测试了几种探针在活细胞中的代谢型标记。Ac4GlcNNorboc产生了较强的标记信号，如前所述这很有可能是非特异性蛋白标记引起的。而作者构建的磷酸修饰糖探针Ac3GlcNNorboc-1-P(SATE)2也表现出了强烈的标记信号，之前已经证明过，该探针的标记信号不会是蛋白质非特异性标记引起的，因此该探针的标记性能优于乙酰化糖探针。作者将已知有O-GlyNAc糖基化修饰的蛋白与eGFP共表达后进行代谢型标记，免疫沉淀后再将分离的蛋白与四嗪修饰的Cy3进行反应，验证了探针标记O-GlyNAc糖基化修饰的效果，四种探针均不能标记eGFP这种非糖基化蛋白。作者还证明了降冰片烯修饰的糖探针是由糖基转移酶OGT的作用以O-GlyNAc的形式掺入蛋白的，并且掺入后不能被糖苷酶OGA切割，因此在标记过程中无需额外添加OGA抑制剂。最后，作者进行了活细胞中蛋白质糖基化的成像。作者以核蛋白p53和细胞质蛋白Foxo1作为模型蛋白，在HEK293T细胞融合表达了感兴趣蛋白(POI)与eGFP，然后进行降冰片烯糖探针的代谢型标记，再在培养基中加入四嗪修饰的四甲基罗丹明(Tz-TAMRA)，利用两种染料之间的FRET效应对糖基化进行成像。总之，作者开发了一种新型的代谢型糖探针，可以免受S-Glyco非特异性蛋白质标记的影响，并在活细胞层面进行O-GlyNAc糖基化修饰的鉴定。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202320247
原文引用：DOI: 10.1002/anie.202320247
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