华东理工大学郑高伟教授课题组ACS Catalysis:多酶级联催化乳酸的从头合成

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第一作者:丁旭伟

通讯作者:郑高伟 
通讯单位:华东理工大学 
论文DOI:10.1021/acscatal.3c05489


  


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本研究基于酶催化单元模块按需组合的多酶合成路线构建思路,建立了甲醇生产D-、L-和外消旋乳酸的多酶催化合成途径;通过优化单元酶催化模块和多酶系统,将乳酸产物浓度提高到2.2–2.8 g/L,最大合成速率达到9.6–15.6 g/L/天,乳酸光学纯度达到99%。


  


背景介绍
A. 生物固碳途径
在自然演化的过程中,自养微生物逐步演变出固定CO2的途径,将其转化为有机生物质,例如卡尔文循环(占90%)、还原性TCA循环、WL途径等。然而,这些天然的固碳途径存在一些缺陷,如固碳途径长,效率低(受到高氧化态CO2的限制,需要克服较高的能垒,使得羧化酶成为限速步骤)。随着合成生物学的发展,研究者逐步聚焦于人工固碳途径,主要包括改良天然固碳途径以提高固碳效率,以及设计全新的固碳途径。2016年,Erb团队构建了第一条体外人工固碳途径(CETCH循环),共包含17个酶,实现了乙醛酸的从头合成,固碳效率达到5 nmol CO2/(min·mg),为构建人工固碳途径开辟了新的道路(Science 2016, 354, 900–904)。2021年,马延和团队以CO2H2为原料,设计了人工淀粉从头合成途径(ASAP),固碳效率达到22 nmol C/(min·mg),比玉米中的淀粉合成速率高约8.5倍(Science 2021, 373, 1523–1527)。这些突破为后续的研究人员提供了宝贵的参考。

B. 甲醛酶的创制
除了CO2的直接固定外,对其还原衍生物(如甲酸和甲醇)的利用和转化以合成多碳化学品也至关重要。其中,甲醛酶(FLS)是一种苯甲醛裂解酶,首次通过蛋白质设计进行工程改造,用于直接连接C1单元酶催化剂(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 3704–3709)。FLS能将三分子甲醛缩合成一分子DHA,成为唯一已知的能够催化C1C3转化的酶。由于DHA可通过磷酸化进入糖酵解途径成为最终产物,因此甲醛酶可以轻松地整合到代谢中,实现一生二,二生三,三生万物的理念。尽管相对于CO2的固定,甲醛酶催化的缩合反应在热力学上更为有利,但其局限在于催化活性低,需要通过蛋白质工程大幅提高其活性。

C. 乳酸的合成方法
乳酸是我们最为熟悉的平台化合物之一。工业上约90%的乳酸是通过微生物发酵法生产的。然而,其原料主要依赖于糖类化合物和部分生物质。糖类物质(如葡萄糖)的持续供应存在不确定性,并且与我们竞争粮食的消费,可能引发潜在的粮食安全问题。生物质虽然可作为替代原料,但由于无法被微生物直接利用,其前处理也会带来一定成本负担。因此,迫切需要开发新的乳酸合成途径以解决这些问题。


  


研究出发点
鉴于先前的研究人员在人工固碳领域的杰出工作,我们也希望在此基础上进一步设计更多的固碳途径。我们选择乳酸作为目标分子,因其具有两种构型(D-乳酸和L-乳酸)。迄今为止,从C1原料到光学纯的乳酸生物合成途径尚未有报道。我们基于途径短、能量供应较少、采用纯酶法的原则,设计了三条非天然的L-D-和外消旋乳酸的合成途径。途径中所有酶的基因序列是可获得的,以便于后续的分子学操作。最后,我们对途径进行了不同方面的优化,以尽可能提高整体的乳酸合成水平。


  


图文解析
A. 途径设计
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甲醇到乳酸的合成路线

我们将整个合成路线划分为两个模块。模块一的底物是甲醇,可通过电化学催化从CO2制备而来,经过AOXFLS双酶催化得到产物DHA这个模块也是构建C1原料的生物利用途径常用的模块。模块二则是从DHA出发,经过3-4步反应合成D-L-和外消旋乳酸。关于模块二,起初设计了多种合成路线,考虑到路线长度、辅因子需求、手性控制、热力学以及催化剂的效率,最终选择了图中的路线。整体合成路线在热力学上是有利的,有助于推动级联反应的正向进行。

B. 元件组装
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酶元件的筛选

在设计好合成路线的基础上,接下来是筛选对应步骤的酶元件。尽管一些反应步骤已经被报道,但我们仍然尽可能筛选更多的基因,旨在找到催化效率更高的元件,并为后续研究提供更多功能酶信息。其中,我们首次挖掘到在大肠杆菌中可溶性表达,并且对甲醇具有氧化活性的醇氧化酶AOX。我们对其进行了三轮定向进化,使其催化效率提高了5倍,kcat达到了10 s–1。然而,总体而言,FLS和AOX仍然是限速性步骤。在后续工作中,我们将继续对它们进行分子改造,以进一步提高其催化效率。

C. 模块优化
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模块二的组装和优化

除了通过蛋白质工程提高限速酶的效率外,我们还尝试进行反应工程的优化,以提高整条合成路线的整体合成水平。在模块一中,由于中间体甲醛的毒性,我们重点对催化剂的载量进行了优化,使得DHA的合成速率接近最快,从而减少体系内甲醛的积累。在模块二中,我们重点优化了涉及磷酸基团转移的反应步骤。根据之前的热力学计算结果显示,磷酸化和ATP再生循环相对于其他反应而言热力学上不利,因此成为限速步骤。通过文献调研,我们发现多聚磷酸和Mg2+的浓度对热力学平衡有影响。因此,我们对这两者的组合进行了细致的探究,筛选出了合适的反应条件,进一步提高了合成速率。综合而言,模块二能够实现15 g/L的合成水平。

D. 一锅合成
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一锅两步法合成乳酸

在最终设计级联合成模式时,我们对各元件对甲醛的耐受性进行了表征,发现DHAKD-LDH对甲醛的毒性影响较大。为了缓解甲醛的抑制作用,我们设计了一种一锅两步法的合成方法。在起始反应中,我们首先投入模块一进行反应,经过3小时后甲醛的积累减少,然后我们继续将模块二投入反应中,持续进行3小时。总体而言,人工乳酸合成途径能够达到2.2–2.8 g/L的合成水平。


  


总结与展望
C1原料甲醇出发,我们设计了三条到D-L-和外消旋乳酸的多酶催化合成途径。通过模块化的构建和过程强化,最终实现了2.2–2.8 g/L的乳酸合成水平,最大合成速率达到了9.6-15.6 g/L/天,并且乳酸的光学纯度达到了99%总体而言,该路线仍然受到模块一的限制,因此,通过蛋白质工程大幅提高FLSAOX的催化活性将会是后续的重要工作。


  


心得与体会
虽然人工乳酸合成途径相比传统发酵法具有一些优势(如底物供应、途径简短、易于操控),但不可否认的是,以糖和生物质为原料的发酵法能够实现很高的滴度(百克每升)。因此,我们将在未来的工作中进一步优化合成路线,以降低成本、提高产率。因此,无论是人工乳酸的合成还是其他产品的从头(C1原料)合成,都处于一种理念状态,短期内难以实现。因此,需要更多的工程研究来实现从“01”“1100”的技术需求,我们需要投入更多的工作,以真正为碳中和做出贡献。


最后,总结一下,关于生物固碳的工作可以围绕以下几个方面展开:
1. 探索新的天然固碳途径(难度大,可以考虑脱羧途径);
2. 研究羧化酶(发现新酶、研究机制、探索催化功能);
3. 设计人工固碳循环(借鉴Erb团队的经验);
4. C1原料合成多碳化合物(探索丙氨酸、三羟基丙酸、丙烯酸、草酰乙酸甚至六碳化合物等)。

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