将蛋白质翻译增强的总体效果剖析为两个因素：mRNA 稳定性（半衰期，t1/2）和翻译效率 (TE)。以亚细胞分辨率量化 RNA 拷贝数，其中 STARmap 检测转录本，RIBOmap检测 mRNA 拷贝的核糖体结合部分（图 a）。比传统的批量Northern印迹或RT-qPCR方法提供更准确的胞浆mRNA定量。STARmap 和 RIBOmap 结果概括了我们的细胞荧光素酶测定中观察到的趋势，使用从相同生物条件重新接种的细胞的 FLuc RIBOmap 和 STARmap 信号的比率来近似 FLuc mRNA 的 TE（图 b）。无论化学修饰和拓扑结构如何，24 小时 TE 的差异都不显着，这表明多个 Poly(A) 分支不会阻碍或增强 TE。为了进一步表征不同时间点RNA翻译的动力学，我们合成了编码降解决定子标记的FLuc（Firefly-PEST）的mRNA转录本，发光衰变动力学表明单独的化学修饰将发光 t1/2，多尾 mRNA将 t1/2 增加，证实了具有化学修饰和分支尾部的 mRNA 的长期活跃翻译（图 c）。电泳迁移率变动测定，线性和支化 Poly(A) 的第一位移的 Kd与先前报道的纳摩尔范围内的 PABPC1-poly(A) 尾部的 Kd 一致。虽然线性寡核苷酸在 21 nM 处表现出第二次位移，但多尾 Poly(A) 寡核苷酸在 11 nM 处表现出第二次位移，以及在 15 和 35 nM 处额外的第三/第四次位移，这表明每个分支 Poly(A) 尾也结合 PABPC1 蛋白（图 d）。用 HeLa 细胞胞质裂解物处理同一组四种聚 (A) 寡核苷酸，以评估其降解率。我们使用 30 nt（至少一个 PABPC1 占据位点作为功能性 Poly(A) 尾的估计）作为量化功能性 Poly(A) 尾完整性（图 e）。化学修饰和 RNA 拓扑结构都有助于聚腺苷酸的功能和稳定性。

受到细胞内结果的鼓舞，我们在小鼠中检查了多尾 mRNA 构建体。合成的 mRNA 被封装在脂质纳米颗粒（LNP）中，并通过眼眶后（RO）注射进行给药（图 a）。效果显著（图b，c）。mRNA 和 Poly(C) 阴性对照，并且显着低于用 Poly (I:C) 治疗的小鼠，Poly (I:C) 是一种已知的 RNA 免疫敏化剂，可被 Toll 样受体识别，诱导干扰素-β 的释放（图d-f）。结果表明，支链聚腺苷酸拓扑结构和非天然三唑化学键不会导致体内长期免疫毒性，同时能够在低剂量下实现高蛋白表达，证明它们适合用作治疗性RNA。为了直接评估体内修饰 mRNA 的稳定性和可翻译性，我们还使用 RO 注射和相邻小鼠肝脏切片的分析进行了平行 STARmap/RIBOmap 实验，注射后 24 小时的仅 mod 和多尾 mRNA 与模拟 lig 相比显着稳定。控制如 STARmap 所示（图 h，i）。尽管 STARmap 测量的 mRNA 水平相似，但多尾 mRNA 在 RIBOmap 中产生的信号比仅 mod-only mRNA 多约 1.7 倍，这与此时 NLuc 蛋白定量增加约 2.0 倍一致，表明多个化学稳定的尾部更好地保留了 mRNA 的可翻译性，以实现体内较长时间的蛋白质生产（图 j，k）。

  转染了表达不稳定降解决定子标记的绿色荧光蛋白（uGFP）的报告HEK细胞系，该细胞系具有分支/线性Cas9 mRNA和两个靶向uGFP CDS的单向导RNA（sgRNA）以进行基因删除（图a） 。与仅 mod-only mRNA 和模拟 lig 相比，多尾 mRNA 的 Cas9 蛋白表达水平更高。虽然所有构建体都观察到了可观察到的 uGFP 消融水平，但我们发现多尾 Cas9 mRNA 构建体导致整个转染细胞群中 uGFP 水平最大下降（图 b）GFP荧光还忠实地反映了通过下一代测序（NGS）量化的基因组编辑事件，uGFP阳性细胞的百分比与编辑效率呈线性和负相关（图c）。受到这些初步体外结果的鼓舞，我们使用 LNP 中与 sgRNA 共配制的多尾 Cas9 mRNA 在小鼠肝脏中进行体内基因编辑。化学修饰的 sgRNA 旨在靶向 Pcsk9 和 Angptl3，这两个基因与脂蛋白稳态有关，其 KD 已显示出作为治疗家族性高胆固醇血症的治疗策略的前景（图 d）。检测到多尾构建体的 Cas9 蛋白表达水平比仅 mod mRNA 高（图 e）。化学和拓扑 mRNA 修饰在 Pcsk9和 Angptl3上产生显着更高的编辑效率（通过 NGS 量化）与模拟 lig 获得的结果相比。（图 f、g）。用模拟 lig 治疗的小鼠。Pcsk9 中的 mRNA 和Angptl3 中的 mRNA减少了很少（图 h,i）。