大分子药物引起的免疫反应是评估其安全性和有效性的重要指标，也是监管机构、制药企业和患者共同关注的。开发可靠且可重复的抗药抗体（ADA）检测方法是至关重要的，这很大程度依赖于关键试剂的性质和质量。根据ICH M10，关键试剂是指对生物分析测定结果有直接影响的测定成分。生物素（Biotin）标记蛋白是ADA测定中最常见的关键试剂（见图1），其管理（包括标记、表征和储存等）是直接影响ADA检测的重要因素。

    生物素化试剂的结构是类似的（如图3所示）。我们应基于其独特的理化性质来选取生物素化试剂，如间隔臂长度、溶解性（疏水性）和反应位点等。

     间隔臂是反应基团和标记分子之间的化学链。间隔臂的长度决定了标记产物的柔韧性。间隔臂越长则柔韧性越强，并且反应空间位阻越小。例如，如图4所示，偶联在抗体中间区域的LC-biotin的反应位阻大，不易与链霉亲和素结合，而NHS-LC-LC-biotin的间隔臂长度为30.5 Å，相较于NHS-LC-biotin的间隔臂（22.4 Å）长，可降低反应的空间位阻，偶联的LC-LC-biotin更容易和链霉亲和素结合。间隔臂按长度可分为三类：短间隔臂（小于15 Å）、中等间隔臂（15.1-30 Å）和长间隔臂（大于30 Å）。通常，中等间隔臂的生物素化试剂就能满足分析方法的需求。

图 4. 间隔臂长度的影响

      水溶性生物素化试剂，如磺化生物素化试剂（Sulfo-NHS-LC-Biotin和Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin等）和其他形式的生物素化试剂（NHS-PEGn-biotin等）相较于疏水性生物素化试剂是更好的选择。其中磺化生物素化试剂大多是通过非极性疏水烷基链间隔臂与蛋白伯胺共价结合，增加了标记蛋白的疏水性。随着时间的延长，疏水性标记蛋白可能会缓慢聚集，甚至活性丧失。而NHS-PEGn-biotin在不加入非极性疏水烷基链间隔臂的情况下增加了生物素化试剂的水溶性，同时，聚乙二醇间隔臂的亲水性降低了长期储存期间标记蛋白缓慢聚集的风险，较长的PEG间隔区还允许生物素和其他相互作用分子之间有更大的距离，从而最大限度地减少生物测定中的空间位阻。在实际应用中，我们应综合考虑生物素化试剂和标记后蛋白的溶解性来选择标记试剂。

     可用于偶联生物素的蛋白位点包括伯胺、巯基、羰基和羧基。蛋白具有复杂的三级结构。这些位点有的分布于蛋白表面，有的分布于蛋白内部，有的分布于抗原抗体结合功能域。偶联位点的可及性以及蛋白质生物活性的保持，均需重点考虑。

     伯胺存在于每条多肽链的N-末端以及赖氨酸残基的侧链中。由于伯胺在生理条件下带正电荷，因此它通常朝外，裸露在蛋白质表面，使得其更易于偶联而不会使蛋白质结构改变，并且，伯氨可反应的化学基团种类多，可供选择的生物素化试剂丰富。因此，伯氨是最常用的生物素偶联位点，许多生物素化试剂均靶向伯胺。

     修饰过程不会影响蛋白的生物活性是标记的基本要求，如果生物素化试剂靶向的特定基团对蛋白质的生物活性至关重要，则对此种关键基团的生物素修饰可能导致蛋白的生物活性丧失。根据生物素化程度的不同，可能会发生完全丧失活性的情况。

     不同检测方法对生物素化关键试剂的要求不同，我们可根据蛋白的功能结构域和可偶联位点，选择合适的生物素化试剂，确保检测性能的最优化。

      在大多数成功的新药开发项目中，临床药代动力学和抗药抗体测定可能需要持续近十年或更长时间。这给标记蛋白带来了长期稳定性的巨大挑战，只有试剂（特别是关键试剂）长期稳定且可获得，才能确保检测方法能够支持新药的开发。因此，关键试剂的储存十分关键。

      试剂的储存介质是决定试剂长期稳定性的重要影响因素。在选择储存介质时，应考虑以下几个方面，包括但不限于蛋白分子的等电点（pI）、储存温度、稳定剂和抗菌剂等。

    蛋白质在等电点（pI）时最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体而沉淀析出。储存介质的pH不合适，可能会导致蛋白聚集、沉淀。储存介质应在选定的pH下具有足够的缓冲能力，且适合蛋白质稳定保存。其缓冲能力将取决于所选弱酸或弱碱以及相应盐的离解常数。例如，含有乙酸盐的缓冲溶液应调节pH至5.0，这是因为乙酸盐的缓冲能力在乙酸的pKa附近（3.7–5.6）。对于pI >7.0的关键试剂，推荐使用pH 5左右的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作为储存介质，或是pH 6左右的含氯化钠的组氨酸缓冲溶液。对于pI <7.0的分子，可能需要具有更高缓冲能力的溶液，例如HEPES或磷酸盐缓溶液。

    关键试剂的长期存储稳定性是需要持续监测的，2014年，EBF对关键试剂的长期存储温度进行了讨论，对标记的关键试剂的存储给出了建议（见下表）。EBF建议关键试剂的稳定性测试应基于其在 ADA检测中的性能，并结合现有的分析数据以及其它稳定性数据，作为稳定性评估的基础。

     在缓冲溶液中添加冷冻保护剂，可以减少冻融循环对关键试剂的影响。冷冻保护剂可防止冰晶的形成，避免蛋白质结构被破坏。常用的冷冻保护剂有蔗糖、海藻糖和甘油。如果需要，可以使用叠氮化钠或ProClin 300等抗菌剂来防止细菌污染。当使用含有蔗糖、海藻糖的介质或乙酸盐缓冲液在4℃温度下储存关键试剂时，抗菌剂的加入尤其重要，以避免关键试剂被细菌污染和降解。

   总之，虽然目前没有关键试剂管理的具体指导原则，但关键试剂的管理越来越受重视。关键试剂是检测方法性能稳定表现的基础，当其发生变化时可能会改变方法的性能，从而影响分析结果。例如，不同种类的生物素，不同批次的生物素化蛋白，产生的检测效能均可能不同。深入了解蛋白药物的结构和生物素化原理，选择合适种类的生物素化试剂，获得性能优异的生物素化蛋白，制定完善而合理的生物素化蛋白的储存和使用流程，是优化关键试剂进而改善检测性能的有效途径。制药企业和CRO有责任采取适当的措施和方案，以确保在药物开发过程中，关键试剂是长期稳定、可持续和一致的。随着越来越多大分子药物被开发出来，可以预见的是，将需要性能更加优越的关键试剂来评估这些药物的免疫原性。