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介绍一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，标题是“Glyco-Engineering Cell Surfaces by Exo-Enzymatic Installation of GlcNAz and LacNAz Motifs”，通讯作者是加拿大女王大学的Chantelle J. Capicciotti教授。在本文中，作者提出了一种新的外源酶糖工程策略，实现在细胞表面安装GlcNAz或LacNAz。
细胞表面糖缀合物的外源酶糖工程可以选择性地展示具有生物正交官能团的确定糖基序，这可以用于研究聚糖与聚糖结合蛋白的相互作用。近年来，利用糖基转移酶安装单糖及其衍生物来编辑细胞聚糖的策略迅速扩大。然而，类似的方法来引入化学报告器功能化2型LacNAc基序尚未报道。本文报道了利用突变型尿苷基转移酶AGX1F383A在C2-位N乙酰基上合成非天然的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc核苷酸糖，这些糖具有叠氮化物、炔和双吖丙啶的功能基团。研究人员检测了非天然的UDP-GlcNAc衍生物作为人UDP-GlcNAc转移酶B3GNT2的底物，发现修饰的供体对转移具有耐受性，尽管程度低于天然的UDP-GlcNAc底物。当GlcNAc衍生物作为人UDP-Gal转移酶B4GalT1的受体底物进行检测时，所有衍生物都具有良好的耐受性，并且该酶可以成功地形成衍生的LacNAc。B3GNT2还用于外酶法将GlcNAc和非天然GlcNAc衍生物安装在细胞表面聚糖上。通过B4GalT1和UDP-Gal进一步扩展GlcNAc-或GlcNAz-工程细胞，产生LacNAc-或LacNAz-工程细胞。作者的概念验证糖工程标记策略适用于不同的细胞类型，这扩展了外源酶聚糖编辑工具箱，以选择性地引入非天然的2型LacNAc模序。 细胞表面具有一层厚厚的糖被，作为聚糖结合蛋白（GBP）的配体，它们介导了一系列生物学过程，包括细胞粘附，通讯，免疫响应，宿主-病原体相互作用等。2型LacNAc由Gal-β1,4-GlcNAc组成，是许多GBP的结合模序，如Galectin识别其β-Gal组分。LacNAc以单个或重复单元形式存在于杂合型和混合型N糖链分支，黏蛋白型O聚糖或糖脂上。或者以唾液酸化LacNAc或Lewis抗原的形式游离于细胞膜。此外polyLacNAc的链长对免疫细胞稳态具有影响，在一些恶性肿瘤中丰度也较高。 此前已经有利用SiaT或FucT安装叠氮，炔基，双吖丙啶，生物素等糖单体的细胞外源酶工程工作报道。人类的2型LacNAc由β1,3-GlcNAc转移酶和β1,4-Gal转移酶进行顺序合成，具体为B3GNT2和B4Gal1，佐治亚大学的Geer-Jan Boons教授曾经用B3GNT2和B4GalT1在红细胞表面构建LacNAc，作为流感病毒A的配体，但采用非天然糖的构建工作还没有报道。
图1 在细胞表面安装2型LacNAc基序的一般外酶糖工程策略
鉴于LacNAc结构的重要生物学功能，作者尝试扩展外源酶工程策略，以设计带有生物正交化学报告基因的2型LacNAc基序的细胞表面聚糖。本文报道了化学酶法合成了一小部分非天然的UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc衍生物，以及人类LacNAc合成酶B3GNT2和B4GalT1对供体和受体GlcNAc衍生物的耐受性。利用GlcNAcT B3GNT2对天然和非天然GlcNAc衍生物进行外酶编辑细胞表面聚糖。GlcNAz修饰的工程细胞也进一步扩展验证了B4GalT1和UDP-Gal，证明了编辑细胞聚糖以展示修饰的2型LacNAc表位的概念验证应用(图1)。
图2 NahK结合PmGlmU与AGX1用于UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc类似物合成
根据已报道的一锅多酶（OPME）体系，作者进一步进行了条件优化，在NahK，AGX1，PmGlmU，PmPPA体系中系统优化了浓度，配比，反应时间等条件，对一系列UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc衍生物进行了合成效率验证，包括azide，alkynyl，diazirine修饰（图2）。
图3 B3GNT2与B4GalT底物特异性探究
在得到一系列UDP糖衍生物后，作者以LacNAcβ-MU为底物，首先在体外验证了这些衍生物能否被B3GNT2催化，并用HPLC-MS进行反应监测（图3）。其中，天然底物UDP-GlcNAc在6h内有85%转移得到三糖。UDP-GlcNAz，UDP-GlcNAl和UDP-GlcNDAz在2h时转化率分别为9%，24%和5%，24h时转化率分别为35%，50%和16%。通过从1 eq提高5 eq，UDP-GlcNDAz的转化效率提高到18%。而相对来说，B4GalT1对UDP-GalNAc衍生物的催化活性则相对高很多。
图4 使用B3GNT2和UDP-GlcNAz进行细胞表面聚糖重构
为了进一步探究B3GNT2和B4GalT1应用于外源酶糖工程的可行性，作者分别在Jurkat和U937悬浮细胞系以及HS-578-T和HEK293T贴壁细胞系中进行了验证（图4）。在经过NanH水解细胞表面唾液酸处理后，加入B3GNT2+0.2 mM UDP-GlcNAz 孵育2h，并进一步使用SPAAC反应偶联DBCO-405，使用FACS作为信号读出。此外，作者还使用了western blot+SPAAC偶联DBCO-biotin的方式验证了HS-578-T细胞系体系并获得了较强的信号响应，这与与流式结果一致。而在使用PNGase F进行N糖酶切处理后的B3GNT2标记结果显示信号几乎不可见，作者认为这是由于B3GNT2只能针对N-糖进行标记，而此前文献报道B3GNT2标记范围包括N-糖，O-糖和糖脂。作者认为这是由于HS-578-T细胞系无法提供合适的B3GNT2转糖位点导致。同样的实验现象在HEK293T细胞系也得到了重复，这与此前糖组学分析中报道的HEK293T细胞系具有较低丰度的延伸核心2型O-聚糖结果一致。因此，即使糖脂上具有LacNAc位点，由于延长距离不足的限制也会导致B3GNT2无法有效标记。基于以上的实验结果，作者认为在进行外源酶糖工程时应该慎重选择细胞系。
图5 重构细胞表面LacNAz和LacNAc表位
此外，作者尝试增加UDP-GlcNAz浓度以提高B3GNT2标记效率，发现这一过程是浓度依赖的，这分别在基于SPAAC反应或直接以GSL-II 凝集素标记的FACS作为读出进行了证明（图5）。同时，作者使用GSL-II分别评估了UDP-GlcNAc和UDP-GlcNAz作为B3GNT2底物时的标记信号强度，与此前基于LacNAcβ-MU的验证一致，B3GNT2对于UDP-GlcNAz反应效率较低，在10%左右（Fig 5）。为了证明并非N-乙酰位衍生影响了GSL-II亲和力，作者在先进行过UDP-GlcNAz+B3GNT2处理的细胞中再加入UDP-GlcNAc，发现标记信号能得到很大提升，这证明在UDP-GlcNAz标记后仍保留了较多的LacNAc位点。此外，作者发现UDP-GlcNAl也能经B3GNT2催化进行标记，而UDP-GlcNDAz标记信号非常微弱。 进一步的，作者验证了先通过B3GNT2+UDP-GlcNAz标记LacNAc，再经B4GalT1+UDP-Gal标记GlcNAz的同时生成LacNAz的可行性，并利用GSL-II进行监测。作者发现在第一步酶反应后GSL-II信号有升高，而在第二步酶反应后GSL-II信号完全恢复至对照组水平，这与此前进行体外验证B4GalT1时的结果一致，并且GSL-II对UDP-Gal是浓度依赖的。
总的来说，作者使用B3GNT2和B4GalT1开发了一种新的外源酶细胞表面糖工程策略，为研究细胞表面LacNAc生物学功能提供了新的工具。
本文作者：MY 原文引用：https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00542 责任编辑：LD
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