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推荐一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，文章标题是Proximity-Enhanced Functional Imaging Analysis of Engineered Tumors，其通讯作者是上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心潘秋辉教授和同济大学附属第十人民医院朱小立教授。潘秋辉课题组的主要研究方向是肿瘤基因诊断、发病机制研究和靶向药物研发；朱小立课题组主要通过发展新型DNA技术手段，用于循环肿瘤细胞、外泌体等疾病标志物的检测。
在过去的几十年里，以正电子发射断层扫描（PET）为代表的功能成像（FI）技术已成为继计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）之后肿瘤成像的里程碑。与反映肿瘤物理形状的CT和MRI不同，FI呈现肿瘤的特定功能，这源于肿瘤与正常组织在物质代谢和能量代谢方面的差异。
代谢水平的差异是FI的基石，肿瘤细胞和正常细胞之间特定物质的代谢差异越大，成像的灵敏度和对比度会越高。基于这一原则，研究和寻找差异较大的物质代谢途径并开发相应的造影剂是一个重要的研究方向。然而，肿瘤在分子水平和代谢途径上并没有独特特征或根本差异，与正常组织相比，肿瘤组织中各种物质的代谢水平仅在数量上有所区别，这种差异导致PET成像过程中正常组织中出现背景信号，不利于临床诊断，特别是早期微小肿瘤和微小残留病灶。
在本工作中，作者开发了一种新的功能成像方法——邻近增强功能成像（PEFI），通过对肿瘤细胞和正常细胞使用化学标记的己糖，然后测量这些细胞表面化学标记的糖蛋白的FI信号来实现功能成像。
糖蛋白在细胞膜上分布的数学模型的建立
首先，作者建立了基于糖代谢差异和糖蛋白表达水平的糖蛋白在细胞膜上分布的数学模型。如图1b所示，在一定时间内，肿瘤细胞吸收和代谢了更多化学标记的糖，其细胞膜表面将表达更多具有化学标记的糖蛋白，其含量与糖代谢水平成正比。假设细胞膜膨胀成一个平面，并均匀地分成大小相同的x平方的网格，每个网格都可能有化学标记的糖蛋白（图1c）。当两个糖蛋白彼此相邻时，就会产生一个“连接”（L）。经由概率搜索算法发现，L的数量与化学标记的糖蛋白数量的平方（y）成正比（图1d），即y越多，L越多，两种糖蛋白相邻的概率就越高。因此，根据这个数学模型，糖代谢水平差异可以从3-8倍增加至9-64倍。
图1. 用于增强糖代谢差异的邻近增强功能成像（PEFI）的概述。
PEFI在肿瘤分析中的操作流程
首先，作者用Ac4ManNAz代谢标记细胞，随后用DBCO-DNA偶联，构建得到了DNA工程化的细胞。同时，作者合成了7个双发夹DNA结构，其上有淬灭基团BHQ2和荧光基团TAMRA，用于级联信号放大（图2b）。
PEFI的流程如图2c所示，DBCO-DNA上有一个10 nt的捕获区域，可以与环状DNA（Circle）互补。只有两个靠近的捕获区域可以同时结合并募集一个Circle，而单个捕获区域和Circle的互补长度较短，并且在生理温度下不稳定，因此不能结合。由于肿瘤细胞的代谢效率和糖蛋白表达水平高于正常细胞，DBCO-DNA在肿瘤细胞表面的结合密度高于正常细胞，进而导致肿瘤细胞表面DBCO-DNA彼此相邻的概率高于正常细胞。随后，Circle可以通过链置换反应打开H1，输出初级荧光信号，同时H1的两端暴露出两个相同的序列用于打开H2，并输出次级信号。类似的级联反应一直持续到7个发夹DNA打开，得到指数放大的PEFI信号，从而可视化肿瘤细胞上两个相邻的糖蛋白。相比之下，正常细胞表面上的捕获区域不够接近，无法单独募集Circle，从而导致正常细胞上没有PEFI信号。
图2. 细胞的DNA工程化和PEFI操作的示意图。
PEFI可以可行且准确地识别肿瘤细胞
接下来，作者研究了PEFI方法对肿瘤细胞进行高精度分析的可行性。作者将HeLa细胞用Ac4ManNAz代谢标记48小时，再用DBCO-DNA与细胞表面结合，接着依次添加Circle和7个发夹DNA，最后进行PEFI分析。结果显示，PEFI分析后，在HeLa细胞表面观察到了清晰的荧光信号（图3a和3b）。相比之下，在缺少Ac4ManNAz、DBCO-DNA或Circle其中之一时，细胞表面都没有荧光信号。进一步，作者使用PEFI可视化不同的细胞群，以评估其分析肿瘤细胞的准确性。结果显示，肿瘤细胞表面具有显著的PEFI信号，而正常细胞的PEFI信号很少（图3c和3d），表明PEFI可以准确识别和分析肿瘤细胞，同时减少了正常细胞的假阳性。
此外，DBCO-DNA中摆动区（S）和捕获（C）区的长度对于准确的PEFI分析至关重要。如果S区太短，由于空间位阻，肿瘤细胞将难以捕获Circle；如果S区太长，即使两个糖蛋白不相邻，Circle也可能会被捕获。同样地，太短的C区会使两个相邻的糖蛋白难以结合Circle，而太长的C区不需要接近就可以自行结合Circle（图3f）。如图3g所示，作者通过分析肿瘤细胞和正常细胞之间PEFI信号的差异来优化S区和C区的长度，根据共聚焦成像和荧光信号强度，当S为20 nt，C为10 nt时，肿瘤细胞和正常细胞之间PEFI信号差异最显著（图3h）。
图3. PEFI用于肿瘤细胞分析的可行性和准确性。
PEFI可以显著增强肿瘤细胞与正常细胞之间的信号差异
之后，作者比较了FI和PEFI对肿瘤细胞和正常细胞差异的增强作用。作者将HeLa细胞和L02细胞用Ac4ManNAz培养0、12、24、48、60、72、84和96小时，然后使用DBCO-Cy5进行FI分析，使用TAMRA标记的DNA发夹进行PEFI分析。结果显示，肿瘤细胞和正常细胞表面的FI信号随着糖代谢时间的增加而逐渐增加，并在糖代谢72小时趋于稳定（图4a和4b）。相比之下，肿瘤细胞表面的PEFI信号在糖代谢12小时后就开始增加，而正常细胞表面的PEFI信号直到糖代谢48小时才出现（图4c和4d），即PEFI方法中两种细胞的信号差异明显大于FI，且两种分析方法之间具有高度相关性（图4e和4f）。因此，PEFI分析可以显著增强肿瘤细胞与正常细胞之间的信号差异，从而能够对肿瘤细胞进行准确的成像和分析，并减少来自正常细胞的背景信号。
图4. PEFI可以显著增强肿瘤细胞与正常细胞之间的信号差异。
PEFI可以在组织水平上准确识别肿瘤
为了进一步评估PEFI的应用潜力，作者对切除的肿瘤组织和来自癌症患者的体外培养的肿瘤类器官进行了PEFI分析。作者收集了肝母细胞瘤患者的肿瘤组织样本，在胰蛋白酶消化下研磨成组织碎片，然后使用Ac4ManNAz和DBCO-DNA进行标记，最后通过PEFI分析肿瘤碎片。结果显示，肿瘤碎片表面的PEFI信号清晰可见，而没有DNA功能化的肿瘤碎片，其PEFI信号明显较弱（图5b和5c），对应的组织切片成像也进一步证实了这一点（图5d和5e），证明了PEFI在组织水平上的可行性。
同时，作者研究了PEFI在组织水平上区分肿瘤和正常组织的能力。结果显示，肿瘤类器官可以观察到清晰的荧光信号，而正常类器官则显示出很少的荧光信号（图5f），肿瘤类器官的PEFI信号比正常类器官的PEFI信号强约25倍（图5g）。这些结果表明，PEFI在组织水平上识别肿瘤时，背景信号低和准确性高，证明了其在临床诊断上的潜力。
图5. PEFI在组织水平上分析研究患者来源的肿瘤。
PEFI可以在动物水平上指导肿瘤切除手术
最后，作者将PEFI方法扩展到了动物水平，以进一步探索该方法在临床应用中的潜力。首先，作者建立了移植了4T1细胞的BALB/c裸鼠皮下肿瘤模型，并用Ac4ManNAz和DBCO-LDNA进行标记（图6a）。结果显示，在Circle和DNA发夹给药8小时后，肿瘤部位显示出更高的荧光信号，与周围的正常组织清晰分界，用生理盐水的对照组在肿瘤部位几乎看不到任何PEFI信号（图6b和6c）。随后，作者对小鼠的主要实质器官和肿瘤组织进行了离体成像，结果与活体成像结果一致（图6d和6e）。作者计算了从肿瘤组织到主要实质器官的荧光信号的比率。结果显示，PEFI分析小鼠的肿瘤和正常组织之间的强度差异明显大于对照小鼠（图6f）。
目前，实体瘤手术切除是癌症治疗的主要选择，但是微小肿瘤的识别、肿瘤边缘与邻近正常组织的区分是实现精确肿瘤切除的挑战。鉴于PEFI可以准确区分肿瘤组织和正常组织，作者研究了PEFI通过照亮肿瘤来引导肿瘤的精确切除。如图6g所示，作者将表达荧光素酶的4T1细胞注射到小鼠的腹膜腔中，从而形成小肿瘤结节。结果如图6h和图6i所示，在无PEFI引导时，小而难以区分的肿瘤仍然存在。同时，4T1细胞的生物发光信号与PEFI信号的重叠表明PEFI可以准确识别肿瘤。相比之下，在PEFI引导下对残留肿瘤进行切除后，未观察到明显信号，表明肿瘤被准确且完全的切除了。组织切片成像和H&E染色也表明，切除的小结节组织确实是肿瘤而不是正常组织（图6j-l）。这些结果表明，PEFI在引导临床肿瘤切除手术方面具有广阔的潜在应用前景。
图6. PEFI的动物活体应用和PEFI引导的残留肿瘤切除。
在这项工作中，作者开发了一种基于糖代谢差异的邻近增强功能成像（PEFI）策略，可实现肿瘤的高精度和低背景成像，在细胞、组织和动物水平都能有很好的应用，并成功实现了对腹膜癌小鼠残留肿瘤的PEFI引导的肿瘤切除。
文章作者：CXY
DOI：10.1002/anie.202319117
责任编辑：LD
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