分享一篇近期发表在Polym. Chem.上的研究进展，题为：Amino-modified 2-oxazoline copolymers for complexation with DNA。该工作的通讯作者是来自波兰科学院聚合物和碳材料中心的Natalia Oleszko-Torbus和Agnieszka Kowalczuk。
基于聚合物的非病毒基因传递载体具有多样化的结构和化学性质、低免疫原性、储存稳定等优点。它们能与细胞表面有效交互，促进核酸的内吞和摄取。通过调整聚合物的摩尔质量、结构、阳离子类型以及复合物的表面电荷和构象，可形成稳定的聚合物-核酸复合物。而阳离子聚合物毒性问题可通过与PEG共聚来解决，近年来聚(2-取代-2-噁唑啉)（POxs）作为PEG替代品，显示出广泛的生物医学应用潜力。
本文通过阳离子环氧聚合（CROP）合成了2-异丙基-2-噁唑烯（iPrOx）与2-甲基-2-噁唑烯（MetOx）以及2-(3-丁烯基)-2-噁唑烯（ButEnOx）的共聚物，对共聚物进行改性来研究共聚物中氨基基团与主链的距离对其复合DNA能力的影响，并评估了侧链中具有二级氨基的共聚物的细胞毒性和转染能力。
首先，作者通过CROP法合成iPrOx、MetOx以及ButEnOx的三种共聚物（POxN1pendant、POxN2pendant、POxN2main），并通过thiol-ene点击反应或水解的方法对聚合物进行改性，最终使得共聚物氨基的摩尔分数相似（图1）。作者对所得共聚物的热性和结晶性能进行了分析，结果表明，即使经过长时间的退火，所得的共聚物也不具有结晶能力，这使它们可以用作核酸载体。所有的共聚物可以在一定浓度下在水溶液中组装，颗粒的尺寸不限制其在医学和生物学中的应用。图2. 共聚物的水动力直径分布(7.5 mg*mL−1.25°C) 为了确定这些共聚物是否可能用于与核酸形成复合物，作者分析了它们的ζ电位。25°C下，POxN1pendant聚合物的水溶液ζ电位为+10 mV，而对于POxN2pendant和POxN2main则基本中性。在50°C的温度下，POxN1pendant的ζ值增加到+17 mV，POxN2pendant为+7 mV，POxN2main为+12 mV。这可能表明，共聚物在水中在较高温度下自组装形成更大的结构，可能导致正电荷重新定位到所形成粒子的最外层区域，从而增加表面电荷。 接下来作者研究了聚合物对DNA形成聚合物的能力，并利用动态光散射（DLS）、ζ电位测量和冷冻透射电镜成像来表征所得的复合物。含有二级胺基的共聚物在N/P比值为7和10时表现出了良好的凝聚DNA能力，POxN1pendant中氢键可能干扰凝聚DNA的效果。在25°C的水溶液中，DNA的ζ电位为-140 mV，随着N/P比值的增加，聚合物-DNA复合物复合物的ζ电位显著增加。只有对于POxN1pendant与DNA的复合物，ζ电位表现为正值。冷冻电镜可以看出N/P = 7时POxN2pendant聚合物复合物形成了球形的紧密纳米粒子。在14天期间POxN2pendant和POxN2main与DNA复合物的大小没有明显变化，表明其具有一定的稳定性。以上结果表明含有二级胺基的共聚物，特别是侧链二级胺基的，具有更好的凝聚DNA的能力。（图3）图4. 不同浓度的POxN2pendant的细胞毒性测定 随后，作者选择使用人类纤维肉瘤HT-1080细胞对POxN2pendant共聚物进行了细胞毒性测试。可以看出，在整个研究浓度范围内，共聚物对细胞无毒性。（图4）图5. 不同N/P比下DNA-POxN2pendant的细胞活性和转染效率 最后，作者进一步进行了聚合物复合物转染活性测定，使用POxN2pendant和质粒DNA形成了聚合物复合物，质粒DNA含有由CMV启动子驱动的分泌型Metridia荧光素作为报告基因，能够快速准确地评估转染效率。孵育24小时后的结果以百分比显示，其中对照组是不添加聚合物-DNA复合物的细胞荧光情况。对于实验组的聚合物-DNA复合物，荧光素强度在N/P = 10时显著增加，N/P为10至32显示出最有效的转染效率，同时保持了较高的细胞存活率。这意味着使用含有二级胺基的共聚物与核酸的复合能力较强，且能够很好地被细胞摄取，从而获得了最高的转染效率。（图5） 综上，作者基于iPrOx的共聚物并通过点击化学或水解的方法对聚合物进行改性，得到氨基（侧链一级氨基、侧链二级氨基、主链二级氨基）的摩尔分数相似的共聚物。所有的共聚物在一定浓度下在水溶液中组装。由于一级胺基的存在，POxN1pendant能够与水分子形成更多的氢键，因此颗粒明显较大。将DNA加入到POxN1pendant中，形成了直径大于1μm的聚集体。对于含有二次胺基的DNA-POxN2pendant和DNA-POxN2main，在N/P比为7和10时形成了直径小得多的稳定聚合物。对POxN2pendant进行的研究表明，在较广的浓度范围内，它对来自人类纤维肉瘤的HT-1080细胞无毒，并且能够转染这些细胞。Link: https://doi.org/10.1039/D3PY01313H
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