在过去几十年中，生物正交标记已经成为探索活体生物分子的重要工具。这种方法通过在感兴趣的生物分子中引入化学报告基团，并利用生物正交反应来研究生物过程。由于大多数生物过程是由不同生物分子的相互作用驱动的，因此需要将生物正交反应扩展到多个目标。然而，在同一环境中同时应用多种生物正交反应仍然具有挑战性，因为可能会发生交叉反应。目前，为了实现双重或三重生物正交标记，主要采用两种方法：一是基于不同的反应机理，二是调控化学报告基团的反应性。

在先前的研究中，作者已经成功地利用1-甲基环丙烯修饰的DNA通过IEDDA反应实现了标记。于是，作者希望在之前研究的基础上实现DNA的双重生物正交标记。之前的研究表明，甲基环丙烯的反应性会随着甲基取代基的位置而改变，例如1-甲基环丙烯是应用于IEDDA反应的理想候选物，而3-甲基环丙烯的甲基基团会在IEDDA反应的过渡态中造成空间位阻，但却可以与四唑原位产生的腈亚胺发生光点击反应（图1A）。基于这一理论，作者设计了一系列含有1-甲基环丙烯/3-甲基环丙烯的探针（图1B），希望能够通过IEDDA反应和光点击反应实现DNA的双重生物正交标记（图1C）。

图1 A：四唑类化合物的光点击反应

      B：1-甲基环丙烯修饰的脱氧核糖核苷（1-5）用于IEDDA反应，3-甲基环丙烯修饰的脱氧核糖核苷（6-7）用于光点击反应

      C：结合IEDDA反应和光点击反应对DNA进行双重生物正交标记

在这项工作中，作者的设想是含有1-甲基环丙烯或3-甲基环丙烯的探针在IEDDA反应或光点击反应达到最快反应速率的前提下实现两者的正交标记。基于此想法，作者首先在体外利用二吡啶取代的四嗪8/二芳基四唑9对不同探针的反应速率进行测定（图2A），结果表明探针1和6分别在IEDDA反应和光点击反应中达到最快反应速率，随后作者在体外采用这两种探针来评价两者反应的正交性。作者将探针1和6等摩尔混合在PBS:MeCN（1:1）中，随后分别与二吡啶取代的四嗪8、二芳基四唑9进行反应，并通过HPLC与LC-MS对反应的选择性进行评估，结果表明探针1和6两者的反应相互正交（图2B）。

图2 A：探针1-5与四嗪8、探针6-7与四唑9反应的二级速率常数

      B：用HPLC来分析探针1和6的正交反应性

接着作者在体外DNA水平上设计了引物延伸实验以及后续的荧光标记实验，验证所筛选的两种探针在DNA复制时是否可以被DNA聚合酶识别以及是否可以在DNA水平上实现IEDDA反应或者光点击反应。作者在引物延伸实验中选用了Cy5/ ATTO 390标记的引物P1/P2、模板T1、三种市售的DNA聚合酶，当引物P1与模板T1结合后，在含有不同底物的组（阴性组：含有未修饰的dATP、dCTP、dGTP，阳性组：含有未修饰的dATP、dCTP、dGTP、dTTP，实验组：含有未修饰的dATP、dCTP、dGTP和1-甲基环丙烯修饰的dTTP/3-甲基环丙烯修饰的dTTP）中DNA聚合酶对引物P1延伸5min，随后用PAGE进行分析，结果表明带有1-甲基环丙烯修饰的dTTP或者3-甲基环丙烯修饰的dTTP可以被DNA聚合酶识别（图3A、B）。作者随后用Deep Vent (exo-)聚合酶在底物10/12的存在下对引物P1延伸30 min，接着将1-甲基环丙烯或者3-甲基环丙烯修饰的寡核苷酸进行脱盐、冻干、溶解，并分别用染料11和13进行标记，通过PAGE分析。结果表明1-甲基环丙烯修饰的寡核苷酸可以成功进行IEDDA反应（图3C）而3-甲基环丙烯修饰的寡核苷酸未成功进行光点击反应（图3D）。对于未成功进行的光点击反应可能是由于选择的溶剂无法同时满足反应条件和寡核苷酸样品的溶解性，这也帮助作者调整后续在细胞水平上实现光点击反应的方案。

图3 A、B：引物P1与模板T1结合后，验证三种市售DNA聚合酶是否可以识别带有两种修饰的脱氧核糖核苷三磷酸

     C：b）、c）分别对应于修饰有Cy5的引物P1、成功进行IEDDA反应的寡核苷酸的凝胶内荧光成像，d）两者凝胶内荧光成像的Merge

     D：对应于修饰有ATTO 390的引物P2的凝胶内荧光成像

最后作者开始尝试在细胞水平上将探针1和6掺入到DNA上实现双重正交标记。首先通过设计细胞毒性试验来确定后续代谢标记中使用的探针浓度，通过MTT实验可知探针1和6的适宜浓度均为0.1 mM。接下来作者的想法是将探针1和6分别进行代谢标记，将各自代谢标记的实验条件摸索清楚后，然后再继续将两探针同时进行代谢标记来实现两者的正交标记。在将探针1进行代谢标记的实验中，作者最初将细胞与探针1孵育48 h后用染料11进行标记，但并未观察到染色后的DNA，这可能是由于探针1的代谢效率低或1-甲基环丙烯在染色质结构中的不可及性。随后作者尝试了两种实验方案的改进（① 在使用染料标记前用盐酸盐溶液对DNA进行变性，②针对细胞内核苷酸代谢途径中将脱氧核糖核苷转变为相对应的脱氧核糖核苷三磷酸较为关键，通过添加合成的核苷三磷酸转运蛋白（SNPP）和探针10来提高代谢通量），结果细胞在探针10与SNTT的共同孵育下最后成功观察到了标记的DNA（图4A）。接着在尝试探针6的代谢标记实验中，作者将细胞与探针6孵育48 h后用盐酸盐溶液变性，接着与溶在乙腈中的染料13孵育1 h，然后在 405 nm下照射20分钟，结果表明探针6可以利用光点击反应进行代谢标记（图4B）。

图4 A：HeLa细胞在经过脱氧核糖核苷三磷酸10与SNTT的代谢标记后，与染料11发生IEDDA反应后的激光共聚焦显微成像

      B：HeLa细胞在经过脱氧核糖核苷酸6的代谢标记后，与染料13发生光点击反应后的激光共聚焦显微成像

图5 A：使用脱氧核糖核苷三磷酸10和脱氧核糖核苷酸6用于DNA的双重正交代谢标记

      B：在优化后的实验条件下，在Hela细胞经过脱氧核糖核苷三磷酸10和脱氧核糖核苷酸6的双重代谢标记后的激光共聚焦显微成像

作者的结果首次展示了在细胞中对基因组DNA进行双重生物正交代谢标记，通过将两种异构的甲基环丙烯作为生物正交反应的功能基团连接到两个2'-脱氧核糖核苷酸上，实现了IEDDA和光点击反应的结合。并且与简单的乙烯基团相比，环丙烯因其环张力而具有增强的反应性，并且由于其较小的结构，在细胞环境中对于正交基团的大小和反应性提供了较好的折中方案。

本文作者：WJ

原文引用：https://doi.org/10.1002/anie.202403044