刘子琦，北京大学

大家好，本期为大家介绍一篇 ACS Chem. Biol. 的文章，题目是“Proximity Tagging Identifies the Glycan-Mediated Glycoprotein Interactors of Galectin-1 in Muscle Stem Cells”，通讯作者是美国 Scripps 研究所（Jupiter, Florida）的 Mia L. Huang。

图 1. 邻近标记技术用于 galectin-1 的互作糖蛋白质组的捕捉

糖结合蛋白（glycan-binding proteins, GBPs），是一类能够选择性结合特定糖链结构的重要蛋白质。通过结合细胞表面的特定糖链及糖蛋白，GBPs 能够引起信号转导等细胞生命活动，从而在细胞生长与分化、肿瘤发生、免疫响应、病原体入侵等过程中扮演了不可或缺的角色。因此，研究各种 GBP 的相互作用组，尤其是其与哪些糖蛋白的结合，受到了日益增长的关注。

本工作中，研究者着眼于一种重要的糖结合蛋白 galectin-1（Gal-1）。Galectin-1 被发现在动物的肌肉生成（myogenesis）过程中表达量上调并发挥重要作用，缺失 galectin-1 将导致细胞分化的失调。亦有研究表明这一过程与 galectin-1 的糖结合功能直接相关。因此，对 galectin-1 的研究，将有利于人们研究肌肉再生以及治疗肌肉萎缩等病症。然而，galectin-1 的作用机制仍有待探究，尤其是其相互作用糖蛋白质组的鉴定仍需要完善。以此为出发点，作者采用过氧化物酶 APEX 介导的邻近标记技术，对 galectin-1 在肌肉干细胞（muscle stem cells）表面可能发生相互作用的糖蛋白进行了鉴定与研究。

图 2. APEX2 与 galectin-1 融合表达产物的表征

作者设计将第二代 APEX 酶（APEX2，分子量 29 kD）与 galectin-1 融合表达，从而在 galectin-1 与细胞表面糖蛋白结合时进行邻近标记以捕捉相互作用蛋白。研究者首先考察了在 galectin-1 的 N 端和 C 端融合 APEX2 对其糖结合能力的影响。以已知的结合糖蛋白 asialofetuin 为模型，研究者发现 N 端或 C 端融合 APEX2 之后的 galectin-1 均保留了较好的结合能力。由于 N 端融合产物（NPG1）具有更高的结合能力，作者选其用于进一步的细胞层面研究。

图 3. APEX2-galectin-1 邻近标记体系的荧光成像与 Western 印迹表征

接着，研究者采用 C2C12 小鼠成肌细胞系（myoblast），对 APEX2-galectin-1（NPG1）在细胞表面的邻近标记效果进行了验证。在反应条件（500 μM 生物素-苯酚探针，1 mM 过氧化氢，1 min）下，C2C12 细胞表面发生了明显的标记反应，且低至 200 nM 的 NPG1 即可产生能够观测到的标记信号。作者分别通过荧光成像和 Western 印迹表征了标记效果。同时，若加入高浓度乳糖作为 galectin-1 的竞争结合底物，或者加入 PNGaseF（用于切割糖基化修饰）或 tunicamycin（用于抑制糖基化修饰），则标记效果不明显。以上结果说明细胞表面不仅发生了显著的标记，且标记由 galectin-1 与糖蛋白的结合所介导。

图 4. 标记蛋白的质谱鉴定与数据分析

之后，研究者对标记的蛋白质进行了富集，并进行了质谱蛋白质组学分析。实验中采用了 TMT 同位素标签技术对多组样品进行同位素标记，从而实现同时对多组样品（最多达 16 组）的质谱相对定量。通过生物学重复，作者最终鉴定到了 115 个被显著标记的蛋白，其中有 74 个被认为是 galectin-1 的通过糖链结合的蛋白（通过与乳糖竞争实验组对比得出）。若将实验中 NPG1 的浓度由 5 μM 降低为 1 μM（此时 galectin-1 倾向于以单体形式存在），则该数字变为 50，其中 47 个蛋白与 5 μM 时的鉴定结果重合，说明单体形式和二聚体形式的 galectin-1 的结合底物谱有所不同。

表 1. 质谱鉴定到的 galectin-1 的相互作用糖蛋白（部分）

作者进一步对所鉴定到的蛋白质组进行分析。通过查询 Uniprot 蛋白质数据库，研究者发现所鉴定到的 115 个蛋白中绝大部分（93%）具有 N- 或 O- 糖基化修饰，且其中不乏已经报道的 galectin-1 的结合糖蛋白，如整合素(integrin)-α5/β1（能够粘附细胞外基质）、cadherin-1（能够介导细胞-细胞粘附）、CD44、EGFR、Vcam-1 等；此外，作者还鉴定到了一些定位于细胞外基质（ECM）的蛋白，如 vasorin（Vasn）、fibulin-2（Fbln-2）、Notch-2、Mfgm 等，以及许多定位于成肌细胞表面的 N-糖基化修饰蛋白，如 Epha-2,、CD97（一种 G 蛋白偶联受体）、Gpc1 等。通过对所鉴定到蛋白进行 KEGG 生物学通路分析，作者发现最显著相关的通路是 ECM-细胞受体互作，以及肌动蛋白细胞骨架调节。

图 5. 新鉴定的 Galectin-1 互作糖蛋白的结合验证以及标记体系特异性的验证

最后，作者从鉴定到的蛋白中选取了 Itgβ-3、Epha-2、Ece-1、Notch-2 以及 Gas1 作为生物学验证对象。以其相对应的重组糖蛋白为模型，作者通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定了 galectin-1 与这些糖蛋白的结合能力（反映为半效应浓度 EC50），并以乳糖竞争结合实验进一步佐证。结果表明，galectin-1 对重组糖蛋白形式的 Epha-2、Itgβ-3 和 Ece-1 具有显著的结合能力，EC50 值分别为 14 nM、42 nM 和 156 nM。此外，作者还选取了 CD44（已知的 galectin-1 结合糖蛋白）为对象用于验证 APEX2-Gal-1 能够对互作蛋白进行特异性标记。通过对免疫沉淀法（IP）得到 CD44 糖蛋白进行体外标记实验，并以无 N-糖基化修饰的 CD44（通过用 tunicamycin 处理细胞得到）作为对照，作者发现 APEX2-Gal-1 仅对糖基化的 CD44 有标记。该结果有力地说明了这一邻近标记体系的特异性，以及组学研究数据的可靠性。

综上，作者将基于 APEX2 的邻近标记技术成功地运用在了对糖结合蛋白（GBP）galectin-1 的相互作用糖蛋白组的鉴定上，并发现了多种之前未报道的能结合 galectin-1 的糖蛋白（Epha-2、Itgβ-3 和 Ece-1）。这一研究拓展了人们对 GBP 的相互作用蛋白质组的认知，也对 galectin-1 及其他 GBP 在肌肉生成、疾病等过程中的生物学机制研究具有指导意义。

ACS Chem. Biol. 2021, DOI: 10.1021/acschembio.1c00313

Publication Date: June 28, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00313

Copyright © 2021 American Chemical Society