分享一篇发表在Molecular Cell上的文章:Time-resolved profiling of RNA binding proteins throughout the mRNA life cycle,通讯作者是来自韩国基础科学研究所的V. Narry Kim教授和Jong-Seo Kim教授,前者的研究方向是干细胞、胚胎、癌症、神经系统和病毒中的调节RNA和RNA结合蛋白,后者的研究方向是质谱和蛋白质组学。
真核生物mRNA的生命周期包括几个不同的阶段:转录、前体信使核糖核酸(pre-mRNA)加工、核输出、翻译和衰变。在每个阶段,mRNA与一组特定的RNA结合蛋白(RBPs)相互作用,形成mRNA-蛋白质复合物(mRNPs)。这些RBPs控制mRNA的活性、定位和稳定性,并影响其向生命周期下一阶段的过渡。因此,揭示RBPs的阶段特异性库对于理解mRNA调控至关重要。由于mRNA在其生命周期中不断改变其蛋白质伴侣,但由于缺乏时间分辨率数据,使研究者们对mRNPs的理解受到限制。为了解决这一问题,本文作者通过在细胞中用光活化核糖核苷进行脉冲代谢标记、UVA交联、基于poly(A)的RNA分离富集以及基于质谱法的蛋白质组学技术,提供了时间分辨的mRNA相互作用组数据。为了鉴定在RNA合成后特定时间点与mRNA相关的RBP,作者选择了4sU脉冲追踪的时间分辨mRNA相互作用组分析。作者用4sU对HeLa细胞进行10分钟的代谢标记,这是最短的时间,为蛋白质组学分析提供了足够量的交联材料。标记10分钟后,洗去游离的4sU,然后孵育到所需的时间点。作者选择了从0到5小时的10个时间点(0、15、30、45、60、90、120、180、240和300分钟),这覆盖了已报导的人类mRNA半衰期(平均6.9小时;中位数3.4小时)的大部分阶段。通过将细胞暴露于冰上的UVA照射,在4sU标记的RNA及其密切接触的相关蛋白之间诱导光交联,并立即收获细胞。细胞裂解后,用oligo(dT) beads捕获含poly(A)的mRNA分子,并在含有4M尿素的严格条件下洗涤,以特异性捕获直接与4sU标记的mRNA结合的蛋白。利用这种方法,作者在10个时间点上对700多种RNA结合蛋白(RBP)进行定量,并且这些mRNA结合的顺序与已知的功能、亚细胞位置和分子相互作用非常一致。有趣的是,作者还观察到了意想不到的动态RBPs。例如,转录输出(TREX)复合物直到晚期才被检测到(最大峰值时间,67–77分钟),这表明TREX可能是在mRNA出核后再进行转录,这挑战了目前同时转录和mRNA核输出的观点。另外,应激颗粒蛋白普遍结合老化的mRNA,表明在mRNA生命周期后期发挥的潜在作用。总之,本文研究提供了mRNA生命周期中mRNA-蛋白质相互作用的数据,这些信息可以在chronology.rna.snu.ac.kr获取。文章链接:https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(24)00222-3原文引用:DOI: 10.1016/j.molcel.2024.03.012
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