邻近标记（Proximity labeling，PL）是一种酶促“细胞内”化学反应，它催化活细胞中生物分子的邻近依赖性修饰。邻近标记后的蛋白质可以通过质谱分离和鉴定。邻近标记技术已成功用于表征局部蛋白质组，例如亚线粒体蛋白质组、膜接触位点的蛋白质组，以及传统方法难以研究的活细胞时空相互作用组信息。目前，邻近标记技术不仅可以用于局部蛋白质组定位，还可以用于局部RNA和DNA分析，在阐明活体动物模型的空间细胞-细胞相互作用网络方面显示出巨大的潜力。我们认为邻近标记适合于提取细胞或机体中空间分布的生物学信息，并已经成为空间组学的一个重要工具。
邻近标记是一种多学科的化学技术。近年来，我们和其他团队根据酶化学的调制、化学探针设计和质量分析技术，将邻近标记用于多种应用，并实现卓越的图谱绘制。这项技术已被生物和化学学界所采用。许多生物学家会将邻近标记改造为动物模型中的体内反应。我们实验室在小鼠模型中进行了体内邻近标记反应，并成功获得了肝脏特异性分泌组和肌肉特异性线粒体基质蛋白质组。我们期待邻近标记可以进一步有助于揭示活体动物模型中组织特异性的局部分子信息。
化学家们则采用化学“光催化剂”作为人工酶，以此开发新的邻近标记反应。在光活化下，光催化剂可以通过电子转移或能量转移将前体分子转化为活性分子；而活性分子可以在水溶液中、在一定寿命时间内，与邻近的生物分子发生反应。为了识别邻近标记修饰的生物分子，一般会裂解细胞并富集修饰的生物分子，进而使用测序工具进行检测。在这个分析步骤中，直接检测修饰的蛋白质或核酸上的修饰残基，可以证明它们被细胞中的邻近标记酶或催化剂所标记。在本文中，我们介绍了邻近标记的基本概念以及该方法开发中的多方面进展。我们相信，本文将有助于在生物和化学研究领域进一步利用和改进邻近标记方法，从而发掘未知的空间分布分子、细胞信息、空间组等。
原名：Molecular Spatiomics by Proximity Labeling期刊：Accounts of Chemical Research
大多数蛋白质通过与其他分子的互作网络而发挥作用，因此，蛋白质网络的识别对于理解系统水平的细胞过程至关重要。免疫共沉淀（Co-IP）和分级分离方法有助于揭示空间蛋白质组学信息。然而，这些方法可能会因为人工蛋白质相互作用而产生错误的结果，例如：对裂解物进行纯化时，所有亚细胞微环境都被完全破坏，并在人工缓冲液条件下产生了人工蛋白质-蛋白质相互作用。邻近标记是获得空间分布的分子定位信息的重要工具，被称为活细胞中的“分子空间组学”。邻近标记可以定义为对邻近生物分子（蛋白质、RNA、DNA）的空间限制的酶促修饰反应。该修饰反应可以将生物素或类似偶联物连接于生物分子，因此可以通过链霉亲和素珠或相关方法富集修饰后的生物分子。目前，邻近标记方法已经发展了各种酶促反应。我们将重点介绍广泛应用于生物学研究的两种酶促反应，即过氧化物酶（APEX）和生物素连接酶 （BioID或TurboID） 催化的反应。APEX是一种过氧化物酶，最初是从植物的细胞质中提取的抗坏血酸过氧化物酶（APX），后经工程改造而得。APEX的分子量约为 28 kDa，与绿色荧光蛋白 （GFP） 的大小相似，后者已广泛用于对各种感兴趣的蛋白质进行成像。APX通过芳香族分子（如抗坏血酸、苯酚）的氧化来还原过氧化氢（H2O2），从而在植物细胞抗氧化保护中发挥作用。在此过程中，两个电子从两个酚底物依次提取到APX活性位点内的氧化血红素，酚类化合物则转化为苯氧基类化合物，并可与邻近蛋白质的酪氨酸残基发生偶联。由于苯氧基自由基在水溶液中的半衰期低于1毫秒，因此这些自由基可以靶向距离小于20纳米的邻近蛋白质。相较于野生型酶，工程改造后的抗坏血酸过氧化物酶（APEX，APEX2）具有更强的催化活性。值得一提的是，APEX已经开发了多种衍生化学探针，而其他邻近酶如生物素连接酶（例如，BioID/TurboID）的底物依然没有改进，其根本原因在于APX的晶体结构。基于EMARS方法（一种电镜下原子微观信息测量的方法）发现，APX的血红素结合袋部分处于溶剂暴露的位置，而其他过氧化物酶，如辣根过氧化物酶（HRP），其芳香族底物结合位点位于血红素（方案1）的溶剂暴露边缘。由于苯氧基自由基的产生发生在蛋白质表面，所以APX和HRP具有弱底物特异性。这个特性有利于探针开发，例如不同富集手柄、接头大小和芳香基部分的可变组合，可优化过氧化物酶介导的邻近反应。
方案1 抗坏血酸过氧化物酶（APX，PDB ID：1OAF）和生物素连接酶（BirA，PDB ID：2EWN）晶体结构中底物位置的比较。底物分子的颜色为浅蓝色。邻近标记中广泛使用的另一种酶是生物素连接酶（例如BioID或TurboID）。BioID和TurboID都是大肠杆菌生物素连接酶（BirA）的工程衍生物，分子量约为35 kDa，大于APEX（28 kDa）。这些酶通过酶活性位点内的生物素和ATP之间的偶联反应产生生物素-单磷酸腺苷（biotin-AMP）。由于biotin-AMP是一种亲电子活化酯，当它从活性位点释放时，会与邻近蛋白质上的赖氨酸残基发生反应。最初，野生型BirA被认为是高特异的生物素化反应，仅催化大肠杆菌中一种底物蛋白，即生物素羧基载体蛋白（BCCP）。在该反应中，biotin-AMP通过结合环 （116–124氨基酸） 保持在活性位点内。然而，biotin-AMP可以通过R118G杂合突变体BirA（pBirA或BioID）释放到溶液中。然后它可以与邻近蛋白质上赖氨酸残基的胺基反应。TurboID是通过酵母展示技术获得的BirA的动力学工程改造版本。尽管biotin-AMP在水溶液中的半衰期为几分钟，但BioID和TurboID标记的空间分辨率与APEX相当。原因可能是：赖氨酸是蛋白质表面上丰富的氨基酸残基，在此蛋白质环境下，biotin-AMP的实际半衰期比理论半衰期更短。然而，如前所述，BirA的结合袋对生物素具有高选择性（如方案1中的晶体结构），因此仅有一篇文献通过BioID或TurboID在邻近标记中使用了生物素类似物。APEX和BioID/TurboID均产生生物素修饰的蛋白质，需要使用链霉亲和素富集后进行质谱分析。常规质谱分析方法会检出富集后蛋白质组中的无修饰多肽，因而只能提供间接信息来反映生物素修饰蛋白质组。我们和其他学者发现，修饰区域（例如，修饰位点或修饰肽）的直接质谱检测，可以为局部蛋白质组以及修饰位点的结构细节提供更准确的信息。总体而言，我们认为邻近标记是一种多学科方法，它结合了合成化学（如探针和催化剂设计）、生物化学（如蛋白质工程）和分析化学（如质谱分析）。在本文中，我们概述了合成和分析化学中邻近标记的最新进展，回顾了邻近标记在生物导向中体内应用方面的最新进展，以及化学导向中光催化剂介导的邻近标记的发展。最后，我们将概述邻近标记在生物学研究中的未来前景。在2013年首次使用基于APEX的邻近标记时，制备了生物素-苯酚（BP, 化合物1）并用于绘制线粒体基质蛋白质组（图1a）。BP中酪胺的苯酚部分是唯一与过氧化物酶反应的化学部分，而生物素可用于LC-MS/MS（液相色谱-质谱/质谱）分析前的链霉亲和素富集处理。BP具有中等的细胞膜通透性。将matrix-APEX（靶向线粒体基质的APEX）细胞株与BP预孵育30分钟，再用H2O2处理1分钟，在线粒体内可产生几乎饱和的生物素标记信号，表明了BP可以从培养基渗透多层生物膜进入线粒体基质。接着使用链霉亲和素富集生物素化蛋白质组，并通过质谱分析可获得495种线粒体基质蛋白。我们的结果与OXPHOS（线粒体氧化磷酸化）和TIM-TOM（线粒体蛋白质转运）导入复合体的基质侧局部亚基相符合（图1a）。在495种蛋白中，PPOX和PNPT1（以前称为线粒体膜间空间蛋白）均被matrix-APEX所标记，并通过基于APEX的电子显微镜成像证实定位在线粒体基质内。本论文发表后，可以使用BP研究了各种亚细胞空间，包括膜间间隙、内质网（ER）和质膜（PM）连接、应激颗粒、或G蛋白耦联受体相互作用组。
图1 APEX/HRP 探针的富集手柄和连接子的化学变体（a）BP介导的APEX标记用于线粒体基质蛋白质组的表征。matrix-APEX 检测到的OXPHOS 和 TOM-TIM23亚基（红色显示）。经许可转载，版权所有为美国科学促进会（2013年）。（b）合成的DBP可避免氧化并增强LC-MS/MS中的信号强度。（c） 通过蛋白质印迹法（WB）并使用CB[7]-HRP检测AdP标记的蛋白质。（d）使用APX-CAAX测定炔苯氧基自由基的细胞膜渗透性，其中APX面向细胞质。经许可转载，版权所有为美国科学促进会（2013年）。（e）使用细胞渗透性炔酚在酵母中绘制线粒体基质蛋白质组图谱。经许可转载，版权所有为Elsevier（2020年）。（f）用膜不可渗透的BxxP对突触间隙进行特定绘制的策略。（g）哺乳动物细胞和酵母中探针对膜的渗透性方案。由于生物素和链霉亲和素具有很强的结合亲和力（Ka = 4 × 1014 M –1），因此可以使用链霉亲和素珠分离BP标记的蛋白质。然而，我们意识到如此高的亲和力可能会阻碍生物素化肽从链霉亲和素珠中回收。我们还观察到，在产生自由基的APEX反应过程中，生物素的硫醚基团很容易氧化为亚砜或砜，这就导致修饰肽拥有非氧化和氧化的两种状态。因此，我们开发了脱硫生物素苯酚（DBP，化合物2），其中含有脱硫生物素作为富集手柄。在和蛋白质反应中，DBP在转化为苯氧基自由基状态时表现出与BP相似的反应性。但DBP没有硫氧化问题，与链霉亲和素的结合较不紧密（Ka=1×1013M–1），从而富集DBP修饰肽能获得更高回收率（图1b）。使用DBP，我们可以在质谱中获得更多APEX标记肽，这有助于表征标记膜蛋白的膜拓扑结构。需要注意的是另一种化学富集手柄金刚烷，对其靶分子葫芦[7]脲（CB7）具有高结合亲和力（Ka>1.0×1013 M–1），可用于APEX标记。通过与Kimoon Kim博士的研究小组合作，我们发现金刚烷-苯酚（AdP，化合物3）可与活细胞中的APEX反应（图 1c），并通过蛋白质印迹法（WB）使用CB7-HRP检测出AdP修饰的蛋白质。由于金刚烷修饰的蛋白质可以用CB7偶联珠富集，该方法可用于APEX标记蛋白质的正交富集；而几乎其他邻近标记方法都基于生物素修饰和链霉亲和素珠富集，这在内源性生物素化蛋白质高表达的样品中具有潜在干扰问题。APEX标记的另一个方向是控制化学探针的膜渗透性。BP具有中等的膜渗透性，并广泛用于各种哺乳动物细胞实验；然而，对于复杂的膜结构，如果蝇、秀丽隐杆线虫和酵母，BP的渗透效果一般。为了提高BP的膜通透性，研究者们提出了各种样本处理方法，例如：在果蝇中进行了去垢剂预处理；在秀丽隐杆线虫中进行了bus-8基因敲除以降低表皮完整性；在酵母中使用酶去除细胞壁。然而这些通透性步骤可能会干扰了正常生理功能。在此背景下，炔-苯酚拥有炔烃（一种亲脂小官能团）并可通过点击反应富集，表现出比生物素更大的膜渗透性。首先，测试炔-苯酚1（AP1，化合物4）以评估苯氧基自由基是否能渗透细胞膜。质膜靶向的W41AAPX（活性增强的APX突变体）-CAAX与炔-苯酚1反应，在点击反应之前，几乎没有检测到没有渗透的信号（图1d）。该结果表明，炔-苯酚1是膜透性的，而炔苯氧基不是。利用炔-苯酚2（AP2，化合物5）的这种良好的细胞膜渗透性，通过线粒体基质靶向的Su9-APEX2成功表征了酵母线粒体基质蛋白质组（图1e）。与富集标签一样，连接子大小也对膜渗透性有巨大影响（图1g）。非膜渗透探针可用于神经元内的细胞表面蛋白质组特异性标记。对于细胞表面标记，过氧化物酶应通过蛋白质分泌途径（如内质网和高尔基体）进行运输。膜渗透性的BP不具有细胞表面特异性，因为其既可以与细胞表面定位的过氧化物酶反应，又可以与保留在内质网和高尔基体中的过氧化物酶反应。因此，生物素-xx-苯酚（BxxP，化合物6；x表示己基）可用于绘制神经元兴奋性和抑制性突触间隙的局部蛋白质组图谱（图1f）。使用具有兴奋性突触（LRRTM1和LRRTM2）和抑制性突触特异性锚定（NLGN2A和SLITRK3）蛋白的BxxP和辣根过氧化物酶（HRP），以高特异性（>89%）和高覆盖率（>69%和>46%）鉴定出199种兴奋性和42种抑制性突触间隙蛋白。需要指出，使用HRP是由于其在氧化条件下比APEX具有更强的酶促活性，并在整个分泌途径中可见（例如，ER、高尔基内腔和细胞表面）。APEX标记化学设计的另一个重要进展就是反应基团的修饰。APEX探针芳香基团的化学修饰可以调节其标记半径和对生物分子的反应性。我们在研究APEX的最初工作中，测试了用吸电子基团（EWG）或给电子基团（EDG）修饰BP是否会影响标记活性。我们生成了生物素-2-硝基苯酚（BNP，化合物7）和生物素-1-甲氧基苯酚（BMP，化合物8）。两者都具有硝基（EWG）和甲氧基（EDG）基团的邻位修饰，可以破坏或稳定苯氧基自由基状态。如预期，在W41FAPX-NES或HRP-TM表达细胞中，与BP相比，使用BNP和BMP几乎检测不到生物素标记信号，表明其扩散性极低（图2a）。
（a）BNP和BMP对APX与HRP 的反应性。经许可转载，版权所有为美国科学促进会（2013年）。（b）BP5和BN2的高选择性邻近标记方案，分别用于绘制EGF刺激下胞质中ILK-PINCH-PARVIN-RSU1蛋白复合体的EGFR 相互作用组。评估了BP5和BN2的BDE与反应势垒。（c）筛选BP衍生物对蛋白质、DNA 和 RNA的标记。经许可转载，版权所有为Wiley（2019）。（d）使用Btn-An在细胞表面标记糖基化RNA的方案。通过密度泛函理论（DFT）计算，Tian和同事最近提出：探针内的O–H和N–H键的键离解能（BDE）、酪氨酸残基的反应势垒，能影响APEX的标记效率。在该模型中，低BDE与底物的自由基生成有关，而低反应势垒能与酪氨酸残基上的自由基偶联相关。他们合成了BP5（化合物9）和BN2（化合物10）作为模型化合物，并进行测试：BP5的BDE（O–H）低于BP的BDE，而BN2的BDE高于BP（图2b）。进一步计算表明，BN2在自由基状态下与酪氨酸的反应势垒最低，而BP5具有最高反应势垒。正如预期，由于与蛋白质的反应性较低，BP5显示出与BP相当的弥散的标记性；而BN2则具有更集中的标记性和更高的蛋白质反应性（图2b）。使用胞浆ILK蛋白复合体作为模型系统，使用APEX2-ILK作为诱饵蛋白，测试了BP5和BN2标记特异性。ILK复合体的所有亚单位（如ILK-PINCH-PARVIN-RSU1）均仅由BN2识别，这表明BN2标记比BP和BP5具有更精确和更短的标记半径。最近的研究表明，除了蛋白质外，APEX还可以标记RNA、DNA等生物分子。2019年，Ting和同事报道了使用APEX2绘制局部RNA图谱的方法，称为APEX-seq。该方法利用BP自由基对局部RNA的邻近鸟嘌呤核苷酸残基的反应性，使用链霉亲和素珠富集APEX标记后的RNA分子，并通过测序分析，绘制了亚细胞转录组图谱（包括核亚结构域、细胞质、线粒体膜和内质网胞质膜）。为了提高RNA标记覆盖率，Zou和同事开发了生物素酚衍生物，包括生物素-苯胺（Btn-An，化合物11）和生物素-萘胺（Btn-Nap，化合物10）。Btn-An和Btn-Nap分别显示出最强的RNA和DNA标记信号，而BP对蛋白质的标记效率最高（图2c）。在该试验中，生物素-4-羟基-苯甲酰胺（Btn-4HB，化合物12）也显示出有前景的DNA标记反应性（因为其不与蛋白质或RNA反应）。他们还证实，Btn-An主要与鸟苷反应，因此使用无鸟苷寡核苷酸的标记效率大大降低。使用Btn-An，他们成功地用线粒体靶向APEX2表征了线粒体基质转录组。值得强调的是，Btn-An还用于确认糖基化RNA（glycoRNAs）的研究，而该RNA位于细胞表面并与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）受体家族蛋白相互作用（图2d）。邻近标记是活细胞中蛋白质标记的有力工具，而目前大多数邻近标记的研究均会使用常规的质谱分析。经APEX或BioID/TurboID标记，链霉亲和素珠富集的蛋白质中，会含有无生物素化蛋白质和生物素化蛋白质。质谱分析会将无生物素化肽误判为真阳性结果（即生物素化的蛋白质）。因此，我们使用BioID（Spot-BioID）或APEX（Spot-ID），开发了检测生物素化肽的直接质谱分析工作流程（图3a）。
（a）Spot-BioID的LC-MS/MS样品制备示意图。（b）使用Spot-BioID鉴定雷帕霉素处理下的FRB相互作用对象。标记位点在FKBP25（PDB:2MPH）的晶体结构中高亮显示，而FKBP24-雷帕霉素-FRB晶体结构以带状图（PDB：5GPG）显示。经许可转载，版权所有为美国化学学会（2016年）。（c）通过晶体结构（PDB:6K17）和APEX-EM显示EXD2在线粒体外膜的定位。经许可重印，版权所有为牛津大学出版社（2019年）。（d）绘制线粒体和内质网之间接触位点图谱的Contact-ID方法概述。（e）通过Spot-ID显示线粒体内膜蛋白的拓扑结构。在许可下重印，版权所有为美国化学学会（2017年）。首先，我们建立了Spot-BioID方法，并将其用于绘制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）中的FK506-雷帕霉素结合（FRB）结构域的雷帕霉素诱导的相互作用组。由于在雷帕霉素存在下FRB对FKBP12具有结合亲和力，我们预期FRB-BioID方法处理后，能在雷帕霉素依赖性相互作用对象中观察到FKBP12。令人惊讶的是，我们通过Spot-BioID工作流程的质谱分析，发现仅在雷帕霉素处理下，观察到FKBP25的三个赖氨酸残基（K80、K86和K89）被FRB-BioID生物素化（图3b）。基于此发现，我们进一步获得了FKBP25-雷帕霉素-FRB三元复合体晶体结构，并确认它们的相互作用（图3b）。我们还采用Spot-BioID法绘制线粒体外膜（OMM）锚定蛋白图谱。（Tom20 定位于线粒体外膜）。通过对TOM20-BioID生物素化肽的质谱分析，我们鉴定出含有外切核酸酶3'-5'结构域的蛋白2（EXD2），其K46和K221位点可重复性地生物素化。这一结果与先前发现EXD2的胞核和线粒体基质的定位不一样。因此，我们在固定样品中通过APEX-EM成像确认了EXD2的亚细胞定位，该成像利用3,3′-二氨基联苯胺染色的APEX技术。我们将EXD2的疏水N端（1–37个氨基酸）鉴定为一个OMM特异性信号锚跨膜结构域，用于EXD2定位到OMM。此外，EXD2的K46和K221被面向胞质的Tom20-BioID所生物素化，这表明EXD2（38–621 aa）的可溶性结构域面向细胞质。基于EM成像和Spot-BioID联合LC-MS/MS结果，我们提出了EXD2的膜拓扑结构（图3c）。进一步，我们成功获得了其核酸外切酶结构域的二聚体晶体结构，这表明EXD2在线粒体的胞质面形成了二聚体。然而，EXD2及其在OMM的核酸底物的分子功能仍不清楚，我们目前正在探索这些模型。在最初的Spot-BioID工作流程中，我们首先进行“珠上消化”方案，即在链霉亲和素珠上富集生物素化蛋白，随后进行胰蛋白酶消化。由于链霉亲和素会在珠上被胰蛋白酶消化，因此我们优化并提出了“溶液内消化”方案。在生物素化后，通过超声波裂解细胞和核酸，并通过尺寸排除过滤或丙酮沉淀法除去游离生物素。接着，对总蛋白进行还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化过夜。这种“溶液内消化”可以在肽水平让链霉亲和素珠富集并覆盖更多的生物素化肽。基于这一改进的消化和富集方案，我们对线粒体相关内质网膜（MAM）进行了局部蛋白质组图谱绘制。我们自主设计了一种分裂的BioID系统，称为Contact-ID，核心是使用了晶体结构二分裂的BirA。Contact-ID的每个分裂片段（B1和B2）均不具有生物素化活性，我们预计如果分裂的BioID在MAM的强制相互作用空间中结合为整体，则MAM局部蛋白质可以被生物素化。针对该设想，我们制备了两种构建体：N端靶向ER膜的BioID(B1, 1–78 aa)-Sec61B，和C端靶向OMM膜的BioID(B2, 79–321 aa)-Tom20。我们观察到这些Contact-ID构建体在线粒体和内质网的接触位点产生生物素化蛋白。通过改进的Spot-BioID工作流程分析Contact-ID生物素化的蛋白质，我们鉴定了115种主要为内质网膜（ERM）和线粒体外膜（OMM）注释的MAM特异性蛋白质（图3d）。115种蛋白质中有85种具有一个或多个跨膜结构域，其膜拓扑结构通过标记位点确定。例如，FKBP8是一种已鉴定的OMM蛋白，显著调节内质网和线粒体之间的联系和钙转运。APEX标记位点的直接质谱分析还可以揭示标记膜蛋白的膜拓扑结构，这有助于了解其在膜上的功能。我们使用了Spot-ID方法——即使用可覆盖更多APEX2修饰肽的DBP（图1b），并通过直接质谱分析标记肽，成功鉴定了135种线粒体内膜（IMM）蛋白的膜拓扑结构。在该研究中，由于DBP自由基不能穿过IMM，故使用matrix-APEX2和ScoI-APEX2标记基质和面向膜间隙（IMS）的IMM蛋白质（图3e）。根据这些结果，我们鉴定出77种尚未完全表征的IMM蛋白的拓扑结构，并确认了58种IMM蛋白拓扑结构。此外，几个真正的IMS侧IMM蛋白的修饰肽，却仅由IMS-APEX2特异地检出，而不是matrix-APEX。例如NDUFB10，OXPHOS 复合物I的一种IMS定位的亚基，通过间接邻近标记-ID工作流程鉴定为线粒体基质蛋白，原因可能是其在基质侧与生物素化蛋白发生了强蛋白-蛋白相互作用。我们还证实，在生化测定中，NDUFB10未被matrix-APEX2生物素化。我们的结果表明，邻近标记修饰位点的直接质谱检测，对于通过邻近标记获得空间蛋白质组景观的清晰图像至关重要。值得一提的是，该方法可用于其他化学探针（例如，炔-苯酚）的APEX修饰。越来越多的证据表明，从培养的哺乳动物细胞中获得的蛋白质组学信息可能无法准确反映组织的原始蛋白质组。组织特异性表达数据库（例如，human protein atlas，G-tex）是了解蛋白质组织特异性功能的重要资源；然而，这些数据库不能提供各个组织中蛋白质的空间分布信息。最近，邻近标记已被用于果蝇、秀丽隐杆线虫、小鼠等体内模型中，为组织表达蛋白提供更多的空间信息。在小鼠中，BioID用于绘制突触后抑制和新生突触图谱，而split-TurboID用于星形胶质细胞突触接触位点。APEX还用于绘制小鼠纹状体内的组织特异性核蛋白质组图谱。在这些体内研究中，Spot-ID（APEX2）或Spot-BioID（BioID/TurboID）方法对于邻近标记组织样本的质谱分析是至关重要的，因为在组织样本（包括肝脏或大脑）中存在大量内源性生物素化蛋白。我们最近使用Spot-BioID工作流程分析小鼠中的组织特异性分泌蛋白（iSLET）的表达。由于经典分泌的蛋白质在ER腔翻译，我们预计ER锚定的TurboID会将这些蛋白质生物素化。我们使用Sec61B-TurboID锚定到ER膜并面向内腔侧。我们发现，Sec61B-TurboID保留在ER中，而具有ER保留信号（KDEL）的TurboID可以在内质网应激下排出到细胞外基质中。通过腺病毒转染，在小鼠肝脏中表达Sec61B-TurboID，继而用生物素处理。提取血浆并用胰蛋白酶消化，链霉亲和素富集生物素化肽，（质谱分析）最终鉴定出50种分泌蛋白。小鼠肝脏中Sec61B-TurboID产生的生物素化蛋白显示出与肝源性细胞系（如HepG2）完全不同的表达模式。这一结果强调了体内蛋白质组学的重要性（图4a）。
（a）用于表征小鼠肝脏分泌组的体内Spot-TurboID工作流程。使用SignalP 5.0、Human Protein Atlas和文献中原代肝细胞的LC-MS/MS结果，分析鉴定生物素化蛋白的特异性。（b）提取各种组织的原代细胞，用Spot-ID绘制线粒体基质蛋白质组图谱的工作流程。与HEK293T细胞相比，在小鼠心脏中检测到RTN4IP1的高表达。我们还开发了matrix-APEX转基因小鼠（MAX-Tg小鼠），用于原位分析各种组织中的线粒体基质蛋白质组（图4b）。小鼠取材后，用DBP和H2O2标记心脏、胫前肌和比目鱼肌组织。通过Spot-ID分析，我们在心脏、胫前肌和比目鱼肌组织中分别鉴定了200、248和251个DBP标记蛋白。大部分蛋白质（>74%）被注释为线粒体蛋白质，且多数蛋白质（>88%）定位于基质。其中，网织蛋白4相互作用蛋白1（RTN4IP1）/OPA10在心脏和比目鱼肌组织中可重复富集。从结构和代谢组学分析中，我们确定RTN4IP1/OPA10与辅酶Q的生物合成相关，辅酶Q是肌肉组织线粒体基质中能量产生和抗氧化功能所必需的。利用MAX-Tg小鼠，我们可以探索分化组织中线粒体生物学的各种未知，而这无法使用永生化的细胞系来代替。邻近标记可以揭示活体动物模型中的组织特异性局部蛋白质组学信息，这是传统方法无法实现的。因此，我们预计体内邻近标记有可能广泛应用于各种动物研究，包括疾病模型研究。然而，在使用当前邻近标记工具进行体内研究时，有几个方面需要考虑或研究。例如在APEX中，过氧化物酶反应需要添加外源过氧化氢。由于过氧化氢通过半胱氨酸或其他氨基酸的氧化而诱导细胞毒性，所以小鼠模型中的APEX标记应在小鼠取材后进行。体内BioID或TurboID实验需要外源性添加生物素，而生物素是维生素（即维生素B7），在过量情况下可能导致较低或可忽略的毒性。在未来的研究中，应测试活体模型中TurboID表达可能导致的毒性，原因是内源性生物素耗竭或体内生物素化蛋白过夜积累。我们和其他人最近报道了用光催化剂代替酶的邻近标记概念。铱（Ir）和钌（Ru）配合物已用于通过可见光诱导的能量转移或电子转移产生反应性化学物质。Kodadek小组早些时候提出了Ru（II）联吡啶配合物产生苯氧基的机制。尽管这种方法不能用于活细胞实验，原因是需要外源性添加过硫酸铵来还原氧化的Ru（III）配合物（图5a）；但它仍然用于诱导试管反应中的蛋白质光交联，也促使包括我们小组在内的科学家们开发改进的方法。2016年，我们报道了由光活化Ir（III）配合物诱导的高效酪氨酸-酪氨酸交联反应，使用氧作为电子受体（图5a）。由于Ir配合物具有合适的最低未占据分子轨道（LUMO）能级，因此可以通过光照射将电子转移到氧，有效地生成超氧自由基。然后，氧化的Ir配合物可以从近端酚部分提取电子。通过对无APS的BP二聚体形成的质谱分析，我们确认了光活化铱染料产生了BP自由基（图5b）。我们还在活细胞中观察到这种光催化偶联反应。由于我们的Ir配合物靶向ER膜，我们验证了Ir配合物处理细胞后的，ER靶向蛋白（即Sec61B-GFP）的光催化交联产物（图5b）。
（a）钌和铱配合物的蛋白质-蛋白质交联的机制示意。（b）通过MALDI-TOF检测TIr3对BP的二聚化。靶向内质网的TIr3光交联的Sec61B-GFP的蛋白免疫印迹结果。经许可转载，版权所有为美国化学学会（2016年）。（c）Jurkat细胞膜上的使用铱配合物的邻近标记。（d）Fc配体偶联珠上的曲妥珠单抗抗体，其组氨酸残基使用MAUra进行邻近标记。2020年，麦克米伦和同事利用Ir配合物通过dexter能量转移将二氮丙啶光催化生成卡宾。由于卡宾的半衰期估计约为1 ns，比苯氧基自由基短得多（约0.1 ms），因此光活化Ir催化剂的邻近标记比酶介导的邻近标记具有更短的标记半径。Ir配合物偶联抗体用于绘制细胞表面上的特定蛋白质复合物时，生物素偶联的二氮丙啶可作为Ir配合物的生物素化试剂。使用该方法，通过LC-MS/MS分析鉴定了CD45、CD47和CD29的相互作用体（图5c）。2021年，Nakamura及其同事报道了另一种有趣的使用1-甲基-4-芳基脲唑（MAUra）的光催化邻近标记。他们发现Ru配合物产生单线态氧，将邻近组氨酸残基氧化为亲电氧化组氨酸。反应后，亲核的MAUra可与氧化组氨酸特异性结合，并通过LC-MS/MS分析检测修饰的组氨酸残基。该光催化邻近标记方法用于抗体的特异性修饰，例如Ru配合物和抗体结合的Fc配体共固定珠上的抗HER2抗体（图5d）。由于其他几种化学染料（例如，Rose Bengal）或荧光蛋白（例如，miniSOG62）可以产生单线态氧，这可能会氧化局部组氨酸残基。因此我们预计，MAUra可以成为通过光催化方法中鉴定邻近蛋白质的有效探针。此外，已经开发了通过有机物或遗传编码的光敏剂，并使用炔丙基胺实现了核酸标记。预计炔丙基胺可以通过邻近光催化反应，与核酸的氧化碱产物偶联。邻近标记工具（如APEX或BioID/TurboID）已在亚细胞结构水平上成功绘制了局部蛋白质组图谱。尽管我们和其他人使用APEX或BioID绘制了相互作用组，但应考虑两个问题。第一个问题是活性物质的扩散特性。APEX和BioID/TurboID不仅可以标记几个埃（Å，1 Å= 0.1nm）内的物理相互作用的蛋白质，还可以标记其他的附近蛋白质。其他邻近标记方法使用的扩散活性物质，如卡宾物质（Micromap）或蛋白质偶联AMP酯（Pup-IT或Neddylator），在相互作用组绘制时不仅需要优化标记半径，还需要在未来与其它邻近标记工具进行更深层的比较性研究。为了克服标记的扩散，我们的实验室最近开发了一种可光激活的邻近“交联”工具（Spotlight），它利用了Halo Tag（一种经过修饰的卤代烷脱卤酶）及可见光激活的光交联配体（VL1）。据此，我们成功地揭示了SARS-CoV-2核衣壳蛋白的宿主相互作用组（图6）。
使用光交联配体（VL1）的邻近交联方法（Spotlight）的方案。通过Spotlight鉴定SARS-CoV-2的N蛋白的宿主相互作用组。第二个问题是，进行相互作用组图谱绘制时，邻近标记偶联的（POI）的表达应控制在内源水平，因为过度表达的邻近标记靶蛋白可以在非生理背景下标记蛋白质。对此，可以使用CRISPR-Cas9将邻近标记酶敲入内源性靶基因（GOI），但应确认敲入不会损害GOI功能。为了克服这问题，绘制固定并透化样品的内源性水平的生理相互作用组时，使用性能良好的一抗可以有效地靶向邻近标记酶。这种基于抗体的邻近标记方法，在鉴定相互作用蛋白和POI与DNA结合区方面取得了成功的结果。我们对生物素化蛋白质的分析研究表明，直接识别标记位点（即Spot-ID, Spot-BioID）提供了最准确的空间蛋白质组学信息。我们预计通过邻近标记进行生物素化核酸分析也会取得类似的进展，因为当前的分析发现：微珠在裂解和富集步骤中，会捕获到生物素化与无生物素化的核酸。而直接检测核酸或其他分子上的邻近标记修饰位点，可以提供这些分子在活细胞中空间分布的清晰景观。最后，我们预计未来将会开发出更有效的化学探针，用于核酸或其他生物分子的邻近标记。例如，生物素-苯胺显示出较高的RNA标记活性，我们认为可以通过合理设计或化学筛选方法，开发其他核苷酸或代谢物的APEX探针。我们还期望其他种类的修饰酶，可以像邻近标记工具一样，用于特定的生物分子。还值得一提的是，最近使用光催化剂开发了化学导向的邻近标记。随着光催化剂的化学探针的发展，其可能比酶探针更灵活。我们预计基于光催化剂的邻近标记工具的开发，将会在邻近标记领域形成潮流并成为未来十年的重点。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9118551/
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