核膜（NE）是在真核细胞中分离细胞质和细胞核组分的双膜。 众所周知，NE在动物细胞的有丝分裂过程中发生分解和重组。 然而，对于分裂过程中NE动力学的详细机制尚未完全了解。早期对NE分解和重建过程的研究多是基于对核内膜蛋白的标记，将荧光蛋白与核内膜特异性的蛋白融合表达之后对核膜进行示踪。但是，核内膜蛋白与核内部成分具有特异性的相互作用，这些蛋白的过表达可能对细胞核的功能造成影响。因此发展一种不依赖于对核内膜蛋白的标记，而能够在正常生理状态下对核膜的分解和重组过程进行追踪的策略显得极为重要。

日前，日本九州工业大学生物科学和生物信息学系Shinji Sueda教授提出了一种不依赖于核内膜蛋白的核膜荧光标记方法。该方法建立在来自于古生菌Sulfolobus tokodaii的独特生物素化反应。在生物素化中，生物素蛋白连接酶（BPL）介导生物素与其底物蛋白，生物素羧基载体蛋白（BCCP）的特异性赖氨酸残基连接。其中BPL与其产物生物素化的BCCP形成稳定的复合物。 在此基础上，作者绕过核内膜蛋白的标记而巧妙地将荧光蛋白定位在核膜内侧，成功实现了对NE的无创标记。 该设计主要有两部分元件组成：其一，核膜定位部分，融合蛋白TM-BPL。BPL与人血小板衍生生长因子受体（TM）的单个跨膜结构域融合表达，BPL与TM的C末端连接即TM-BPL。当融合蛋白TM-BPL在活细胞中表达时，BPL朝向细胞质或核质的方向上。其二，信号来源部分，融合蛋白BCCP-GFP-NLS。BCCP连接到GFP的N-末端，在其C-末端携带核定位信号（NLS）。 所得到的融合蛋白BCCP-GFP-NLS在哺乳动物细胞中与TM-BPL共表达。 在表达两种融合蛋白的细胞中，BCCP-GFP-NLS主要通过BPL和BCCP之间的生物素化作用被捕获在细胞核内膜上。从而对NE在有丝分裂过程中的分解和重组过程进行追踪。该成果以Fluorescent Labeling of the Nuclear Envelope by Localizing Green Fluorescent Protein on the Inner Nuclear Membrane发表在ACS Chemical Biology 期刊上

图一，列出了文中所用到的融合蛋白的域结构。虽然单独的TM-BPL蛋白可能位于核膜的内外两侧，甚至与核膜相连的内质网区域，但是在融合蛋白BCCP-GFP-NLS进入细胞核与TM-BPL发生生物素化后，较大分子量的蛋白复合物无法穿过核孔，使得GFP特异性地定位在核内膜。

图2，对表达了三种不同融合蛋白（A： TM-BPL 和 BCCP-GFP-NLS. B：TM-BPL and BCCP-GFP，C: TM-GFP）的细胞进行对比分析。从分布在细胞质和细胞核边缘的荧光信号结果可知，只有同时表达TM-BPL 和 BCCP-GFP-NLS融合蛋白时，GFP才能成功的定位在核膜。而其他两种融合蛋白不能对核膜和细胞质进行区分。

图3为了评估该方法能够实现NE的结构的可视化，将该结构与作为核内纤维网络的核层结构进行比较，并用融合蛋白mApple-Lamin A标记细胞核纤层。实时成像的结果显示了从细胞分裂前期到胞质分裂的过程。 荧光信号在核边缘的定位在中期开始时完全分散（30分钟时），显示NE和核层在这一阶段的分解。NE消失后，在细胞质的整个区域均匀地观察到来自mApple的荧光，表明层粘连蛋白A完全分布在细胞中。另一方面，GFP的荧光来自于细胞中的碎片，从一定程度上验证了NE膜破坏后被吸附到内质网网络的结论。在有丝分裂后，可以观察到NE的重新组装和Lamin A在子细胞中NE上的积聚（90-105分钟）。

图4 为了进一步了解NE和核层的分解和重组时间，作者在有丝分裂期间每隔2分钟拍摄细胞的共焦图像。并且通过GFP和mApple的荧光强度进行分析，实现了对有丝分裂过程中NE和核纤层的分布进行定量分析。

本文基于生物素化的特异性性质，发展了一种不依赖于细胞核膜蛋白标记即能对NE准确定位的策略。首次通过延迟成像的方式清楚的观察到细胞分裂期间NE和核纤层形成过程中的时间差。通过追踪GFP复合体在优化条件下的运动过程，该策略将有利于科学家们提供关于有丝分裂期间NE动力学的新见解。 

Fluorescent Labeling of the Nuclear Envelope by Localizing Green Fluorescent Protein on the Inner Nuclear Membrane（ACS Chemical Biology.,2018, DOI: 10.1021/acschembio.8b00219）

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acschembio.8b00219

SUEDA Shinji，男，1998年于九州大学获得工学博士学位。2017年至今，九州工业大学计算机科学与系统工程学部生物科学与生物信息学教授。日本科学技术总公司研究员，日本科学促进会博士后研究员。主要的研究领域为分析化学及活体有关的化学。