推荐一篇发表在JACS上的文章，题目为“Chemical Proteomics Strategies for Analyzing Protein Lipidation Reveal the BacterialO‑Mycoloylome”，通讯作者是来自中央密歇根大学的Benjamin M. Swarts教授，他的研究兴趣在于用化学方法研究分歧杆菌包膜的组成和功能。
蛋白质脂化动态控制着细胞膜内蛋白质的定位和功能。在棒状杆菌中，有一种独特的蛋白质O-脂肪酰化形式，被称为蛋白质O-分枝菌酰化（O-mycoloylation），指分枝菌酸（一种非常大的疏水脂肪酸）修饰在细菌外菌膜中蛋白质的丝氨酸残基上。然而，与其他形式的蛋白质脂化一样，由于富集和分析脂化肽的固有困难，进行蛋白质O-mycoloylation的研究具有很大的挑战性。基于此，作者开发了一种化学蛋白质组学策略，整合了代谢标记，点击化学，可切割连接体，以及一种新的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法专门用于分析亲脂性且质谱不稳定的O-酰化肽。作者根据已发现的细菌蛋白质O-mycoloylation的途径，模拟O-mycoloylation的供体底物，设计了一种代谢型标记的炔基化学探针O-AlkTMM。O-AlkTMM可以借由O-mycoloylation途径，经过脂质转移酶Cmt1的作用，将炔烃安装到蛋白质上，并且该步骤在细菌的外周胞质进行，因此避免了探针需要穿过整个细胞膜的困难。然后通过点击化学反应进行修饰蛋白的与荧光染料或生物素亲和标签标记，再进一步进行SDS-PAGE分析或者富集进行质谱分析。对于亲和富集，作者在生物素和叠氮反应基团之间设计了DADPS酸切linker，在用链霉亲和素进行富集后进行酸切，得到位点肽段后进行质谱分析，从而得到发生O-mycoloylation修饰的肽段信息。作者首先在荧光胶的层面上验证了通过该方法可以特异性地标记发生O-mycoloylation的蛋白，且富集效果优于传统的基于脂肪酸衍生的探针。然后作者通过CUAAC点击化学反应使蛋白带上生物素标签，富集了被探针标记的蛋白质组，然后进行了无标记定量的LC-MS/MS分析，在所有重复实验中，共鉴定了168个单独的蛋白质，其中有21个蛋白质对比对照组富集丰度上升了3倍以上，其中包括已知的O-mycoloylation蛋白。随后，作者在叠氮基团和生物素间引入了可通过甲酸切割的DADPS官能团，使得蛋白被富集并通过胰蛋白酶消化后，可以通过酸切特异性地释放发生修饰的位点肽段。作者还采用了他们最近报道的LC方法来分离疏水性肽段，并同时使用HCD和AI-ETD碎片化方法来进行质谱分析，检测易裂解的肽段修饰。在HCD和AI-ETD谱图中，作者确定了在m/z值为252.17和270.18处形成了带有和不带水分子加成的质子化修饰的特征离子，这些离子可以在今后的研究中作为这种修饰的特征离子。在之前确定的21个蛋白质中，有12个（57%）也在DADPS富集研究的两组重复中被重复到。最后，作者还在野生型Cg菌株和敲除Cmt1的∆cmt1菌株中进行了组学研究，结果表明尽管发生了少量的Cmt1无关标记，但数据中绝大多数的蛋白质标记都是依赖Cmt的。在蛋白质水平上，检测到的蛋白质其中一半（52%）仅含有一个修饰位点。其他（48%）含有2个或更多的修饰，其中约20%的蛋白质含有了3个或更多修饰位点。总之，作者开发了一种化学蛋白质组学策略，可用于特异性富集并分析疏水性O-mycoloylation脂肪酰化的蛋白。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02278原文引用：DOI: 10.1021/jacs.4c02278
目前评论：