生物素标记 > 行业应用 > Nat. Commun.｜交联空间蛋白质组学提供更精确的亚细胞器定位及膜蛋白拓扑结构
分享一 篇发表在 Nature Communications 上的文章 Cross-link assisted spatial proteomics to map sub-organelle proteomes and membrane protein topologies 。 文章的通讯作者是来自德国莱布尼茨分子药理学研究所（ FMP ）的刘凡教授， 她们组致力于开发交联质谱分析方法来解析复杂生物系统中的蛋白质相互作用图谱。
细胞中存在多种发挥特定功能的细胞器和亚细胞器区域，而 空间蛋白质组学 能够快速全面的对这些区域的特征进行描述。 目前已有通过细胞器分离或者临近标记的空间蛋白质 组 学技术，但是其可控性及亚细胞器定位的准确性仍有提升空间。 在本文中，作者基于交联质谱技术建立了交联辅助的空间蛋白质组学（ CLASP ）技术，来帮助更加精确地 绘制亚细胞器区域的空间蛋白质组。 在全蛋白质组的交联质谱中能够鉴定到已知亚细胞器定位的一些定位标志物蛋白，而 CLASP 技术预期能够在识别这些 LMs 的基础上帮助确定与 LMs 直接交联的蛋白的亚细胞器定位，并提供包括膜蛋白 拓扑结构 在内的更多细节信息。 在实验流程上，作者使用二琥珀酰亚胺基亚砜 DSSO 作为交联剂， DSSO 的交联长度在 0.5-2nm 区间，比邻近标记技术的标记半径更小，预期可以更精确提供蛋白的定位信息。 使用 DSSO 对从 293T 细胞中提取的线粒体进行交联，之后进行酶解、 SCX 分离以及 LC-MS 分析，在 CID-MS2-MS3 模式中，对 MS2 中具有特定交联肽质量差的峰进行 MS3 扫描； 最终的结果搜索后和已有的线粒体蛋白质组数据库进行对比，并绘制蛋白相互作用网络。 在数据分析中，作者首先从 DSSO 交联的样品中鉴定到了 1451 个蛋白的 13971 个独特交联，并在结构已知的蛋白上确认了交联模式符合 DSSO 的特点，这确保了初始数据的可靠性。 去掉蛋白网络中无交联蛋白或者脱节的蛋白簇后，作者得到了更可信的 748 个蛋白产生的 2523 个交联。 将数据中蛋白相互作用链接数足够多且有确切亚细胞器定位的 31 个蛋白与有其他充足数据支持的 213 个高特征蛋白合并作为 LMs ，这些 LMs 延伸出的蛋白网络能够覆盖整个交联网络的 72% ，并涵盖不同的亚细胞器定位，能够帮助确定蛋白的真实细胞定位。 在 CLASP 注释的 LMs 直接交联的蛋白中，约一半蛋白有着与以前报道一致的定位注释； 此外， CLASP 也提供了 3 个新的线粒体相关蛋白信息、修改了 95 个已知线粒体蛋白的亚细胞器定位、更正 24 种膜蛋白的拓扑结构。 和之前报道过的 BioID 的数据相比， CLASP 注释到的蛋白质更少，但是亚细胞器定位效果显著提高，具有更好的空间特异性。 作者还使用了可富集 - 切割的 DSBSO 交联剂进行实验，发现进一步提高了 CLASP 的注释数目，并有相似的精确性。 作者后续又通过共聚焦成像、碱性碳酸盐提取、蛋白酶保护实验等方式验证了 CLASP 提供的新的线粒体蛋白及相关蛋白的定位以及拓扑结构信息，证明了其结果的可靠性； 作者也将这一套方法应用在了小鼠脑部突触囊泡空间蛋白质组的分析中。 最后，文章还提供了自动化 CLASP 的 Python 工具，仅需要 XL-MS 数据和 Swiss-Prot 的蛋白注释作为输入，可供研究者使用。 文章链接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-47569-x 原文引用： https://doi.org/10.1038/s41467-024-47569-x
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