Kimberly Bonger教授，就职于Radboud University Nijmegen。主要研究方向是蛋白质的调节与修饰。

蛋白质的功能与它在细胞内的定位和蛋白质之间的相互作用相关，特定蛋白在细胞间的信息交流、细胞内的信号转导等一系列基本生物过程中扮演着不可替代的角色。实现特定蛋白的标记对于研究蛋白质之间的相互作用，了解蛋白质在细胞内的作用机制非常重要，也为今后的药物靶点设计提供了更多可能。

传统的蛋白质检测方法主要有两种。一种是亲和纯化质谱（AP-MS）。通过构建含有目的基因的载体，载体转染细胞并表达融合蛋白，细胞裂解提取总蛋白，经分离纯化质谱分析，分析鉴定与目的蛋白具有相互作用的蛋白。另一种是免疫共沉淀法：将蛋白质视为抗原，利用抗体与之进行特异性结合，从含有不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质复合物。传统的检测方式需要先将特定蛋白从自然环境中分离出来，可能导致非特异性识别，不能完全反应细胞内真实情况。

近年来，研究者们开发了工程化的蛋白质邻近标记技术^[1]。第一种是基于生物素与生物素链接酶的蛋白标记：BAP是生物素连接酶（BirA）的受体序列。目标蛋白A与BirA构建融合蛋白质，目标蛋白B与BAP融合，在细胞中共表达，当目标蛋白A和B相互靠近，BirA催化生物素和ATP反应活化为生物素-5’-AMP，活化的生物素与BAP序列的赖氨酸残基共价偶联形成蛋白复合物，再通过SDS-PAGE，LCMS/MS分离纯化并进行蛋白鉴别。但是BirA只标记BAP标记的蛋白。在上述基础上，研究人员将BirA进行突变，开发的turboID标记效率更高。turboID不需要特定底物，可实现邻近蛋白质的生物素化。

图1.邻近生物素化的质谱检测

第二种是工程抗坏血酸过氧化物酶介导的邻近标记（APEX)^[1]。APEX技术邻近标记蛋白的一般流程如图2，将细胞与生物素-苯酚共同孵育 30 分钟后，添加 过氧化氢激活酶促反应，生成生物素-苯氧自由基，这些自由基与富含电子的基团发生反应，如和蛋白质特定氨基酸 （如 Tyr、Trp、Cys 和 His） 反应，使生物素被共价连接到蛋白质上，然后再通过链霉亲和素磁珠富集和质谱分析，获得相应蛋白质的信息。

图2.工程抗坏血酸过氧化物酶介导的邻近标记（APEX)

1. 简介

在Kimberly Bonger教授的这篇文章中，介绍了利用N-乙酰基转移酶激活芳基异羟肟酸变成氮鎓离子，和邻近蛋白的亲核性残基进行反应，实现蛋白的标记。N-乙酰基转移酶是一类能催化乙酰基团在乙酰辅酶A和胺之间转移的酶, 以乙酰辅酶A作为乙酰基的来源，可以实现芳胺的乙酰化，也可以催化N-乙酰基-N-羟肟酸芳胺上的乙酰基从N上转移到O上。生成的N-乙酰氧基酯很不稳定，N-O键分裂成氮鎓离子。氮鎓离子在水溶液中是相对稳定的，可以达到微妙的级别。但是由于其本身的缺电性，它很容易与DNA、蛋白质上的亲核的残基发生反应。所以他们利用这种独特的NAT酶介导的N, O-乙酰转移能力，通过将合成的羟肟酸探针(AHA探针)作用于细胞，用于蛋白的标记。

图3

2. 实验部分

为了评价AHA探针结构对标记效率，他们合成了带有不同电性取代基探针的1，3，5，同时也合成了他们的结构类似物2，4，6。首先他们探索hNAT1在体外激活AHA探针进行共价蛋白修饰的能力。用纯化的蛋白hNAT1激活探针1-6，然后将制备的样品加入荧光染料9，探针的叠氮基团与荧光染料9发生一个生物正交反应，反应液终止反应后进行SDA-PAGE。结果表明：AHA探针化合物1，3，5可以实现NAT蛋白的标记，化合物2，4，6未能标记蛋白，证明了结构中羟肟酸的是形成氮鎓离子必须的。其中探针1结合蛋白的效率更高，证明带有给电子基团的AHA探针更利于结合蛋白。

图4

随后探究AHA探针是否可实现标记蛋白的定量分析。探针7连接生物素基团，用链霉素进行富集。结果表明，探针7可以有效地标记NAT蛋白，并且随时间增长，蛋白标记量越多，随着探针浓度增加，蛋白标记量也增多。所以AHA探针可以实现NAT蛋白的一个定量标记。

图5

为验证蛋白的临近标记效果，他们将NAT酶与BSA，GFP,  FK506 binding protein，FKBP 共4种蛋白混合或者是将NAT酶与细胞裂解液混合，细胞裂解液或者蛋白混合液与探针1共孵育，然后用DBCO-Cy5.5 9 生物正交标记蛋白。然后发现在加入NAT实验组中， NAT标记量最多，也验证了这个策略可以对蛋白实现邻近标记。

图6

为了进一步验证NAT酶在亚细胞标记中的应用，利用核定位标签(NLS)和核输出信号标签(NES)将hNAT1分别定位于细胞核和细胞质。共定位成像发现：AHA可以实现亚细胞器内特异性的标记hNAT1。

图7

3. 总结

本文利用N-乙酰基转移酶激活芳基异羟肟酸变成氮鎓离子，利用此反应设计AHA系列探针应用于蛋白标记。在亚细胞器过表达N-乙酰基转移酶，实现亚细胞水平的蛋白质标记。AHA探针可被内源性N-乙酰基转移酶催化并实现蛋白标记，从而可实现细胞内源性NAT酶的活性评价。

[1]杜阳春，唐菁兰，王友军，张晓嫣。活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较  

DOI:10.1021/acschembio.8b00178