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供稿：闵奕豪，武汉大学
校稿：郭霞，袁必锋，武汉大学
推送：郭霞，武汉大学
分享一篇发表在Accounts of Chemical Research上的综述，题目是Probing Nascent RNA with Metabolic Incorporation of Modified Nucleosides，通讯作者是来自加州大学欧文分校化学系的Robert C. Spitale教授。 RNA未知功能作用的发现导致人们对揭示新的RNA分子作为治疗靶标的兴趣增加。RNA代谢标记通过将非天然核碱基和核苷与可用于新合成的细胞RNA的化学修饰的生物正交基团相结合，扩大了RNA的研究范围。目前的RNA代谢标记仍然存在一些关键挑战：（i）非天然类似物的毒性，（ii）缺乏RNA相容的偶联化学物质（iii）修饰类似物在细胞特异性RNA代谢标记中的背景掺入。本文展示了作者实验室为克服RNA代谢标记面临的这些挑战所做的工作。 掺入用于RNA标记的化学手柄 1. 转录后RNA标记 细胞中RNA的旅程始于转录过程，其中DNA依赖性RNA聚合酶在细胞核中合成新生RNA（图1）。核输出后，这些RNA转录本可以被几种酶化学修饰，通过从供体小分子转移官能团来改变某些核苷酸。这些酶提供了通过供体分子的合成类似物将生物正交官能团掺入RNA的机会。 图1 生物系统中各种类型的RNA分子 甲基转移酶（MTases）就是这样一类酶，它将甲基从S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）转移到RNA上的亲核位点。一些MTases可以将修饰的SAM类似物作为底物，在不同位置转移化学手柄（图2A）。另一种RNA修饰酶是细菌tRNA鸟嘌呤转糖基化酶（TGT），它在RNA的特定短发夹环序列中用7-氨甲基-7-脱氮鸟嘌呤（PreQ1）取代鸟嘌呤。TGT被证明能够通过结合含有荧光基团或官能团的PreQ1类似物来标记含有发夹序列的RNA（图2B）。虽然MTases和TGT能够进行RNA标记，但限制于类似物所需的复杂化学合成以及这些酶靶向的有限RNA序列范围。为了标记更广泛的RNA，可以使用polyA聚合酶（PAPs）多腺苷化（图2C）。但是由于上述方法都不能标记所有RNA分子，其在标记新生RNA方面受到限制。 图2 转录后RNA代谢标记策略 2. 转录RNA标记 在RNA合成过程中可以使用共转录RNA代谢标记（图3）。该策略克服了转录后RNA标记方法的局限性，因为所有新生RNA都是用修饰合成的，而只有某些RNA转录本是用转录后RNA修饰酶修饰的。虽然向细胞提供修饰的核苷三磷酸盐（NTP）似乎是实现同转录RNA代谢标记的最有效方法，但非极性细胞膜对带负电荷的NTP的渗透性有限。相反，细胞很容易通过内源性表达的转运蛋白导入核碱基和核苷，它们通过从头合成和/或核苷酸回收途径酶促转化为NTPs。这为RNA代谢标记提供了更好的方法（图3A）。此外，某些修饰的核苷和核碱基是市售的，或者可以比核苷酸和NTPs更容易合成。 图3 通过细胞代谢途径将非天然核苷和具有化学手柄的核碱基掺入新生RNA 酶结构决定核苷类似物的掺入 尿苷胞苷激酶（UCK）是负责人细胞中胞苷和尿苷核苷单磷酸化的酶。UCK的两种亚型在人类细胞中表达：UCK1和UCK2。这些亚型的表达差异显著，UCK1几乎存在于所有细胞类型中，而UCK2仅在一些胎盘细胞中证实表达。它们对修饰嘧啶核糖核苷类的耐受性不同，UCK1的耐受性较低，而UCK2的晶体结构显示在结合核碱的C-5附近有一个小空腔（图4A），这一特征允许在C-5处对尿苷和胞苷进行小的修饰，例如乙炔基（即5-乙炔基尿苷（5-EUrd）和5-乙炔基胞苷（5-ECyd））、溴（即5-溴脲（5-BrUrd））或乙烯基（即5-VUrd），以磷酸化并随后并入RNA（图4D）。 图4 使用修饰的核苷进行RNA代谢标记 2. 改性嘌呤核苷的细胞掺入 腺苷类似物可以通过RNA聚合酶整合到RNA的内部或通过PAP整合到3′末端。因此，PAP的底物选择性也必须与腺苷激酶一起考虑。在哺乳动物腺苷激酶的晶体结构中，C-2、N和N-7位于一个宽敞的空腔中，为这些位点的修饰提供了机会（图4B）。尽管在所有三个位置都有修饰的类似物被证明并入RNA（图4E），最终发生在沃森-克里克-富兰克林（WCF）核糖基表面的修饰（例如N6-丙炔诺酮）可能导致细胞内核酸的严重失稳，并对系统造成致命毒性。因此，C-2（例如2-乙炔基腺苷和2-乙烯基腺苷（2-VAdo））和N-7（例如7-脱氮乙烯基腺苷酸（7-DVAdo））的修饰是研究的首选。 鸟苷类似物用于RNA代谢标记的研究明显较少，由于哺乳动物细胞中的鸟嘌呤核苷回收主要通过嘌呤核苷酸磷酸化酶转化为核苷酸，而嘌呤核苷磷酸化酶的底物范围有限，这意味着其上的任何修饰都会丢失。由此得到的鸟嘌呤通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶合成鸟苷一磷酸，该转移酶具有不同的底物要求。最近，6-硫鸟嘌呤核苷（6-SGuo）被证明可以标记人类细胞系中的RNA，以研究RNA种群的动态。6-SGuo还被用于标记RNA和蛋白质的交联，以通过光活化核糖核苷增强交联和免疫沉淀（PAR-CLIP）等方法研究RNA与蛋白质的相互作用。 3. 细胞特异性RNA代谢标记 研究混合细胞群体中RNA的差异表达对于理解RNA在细胞特性中的作用至关重要。细胞分选是一种通过细胞类型特异性荧光蛋白表达或荧光抗体表面标记来分化细胞的技术。有证据表明，这一过程会在细胞内引起压力导致RNA降解，导致观察到的RNA群体发生不可控的变化。细胞选择性RNA代谢标记可以通过直接修饰靶细胞亚群中的RNA来克服这一缺点（图5A）。例如，“笼状”核苷（N6-苯乙酰基-2′-叠氮腺苷）可以被癌细胞中表达的外源酶选择性地脱保护，如青霉素g-酰胺酶（PGA）。 图5 细胞类型特异性RNA代谢标记与修饰的核碱基 RNA代谢标记的挑战 1. 修饰核苷的细胞毒性 在复杂的生物系统中，如活细胞中，使用修饰核苷进行RNA代谢标记可能会产生意想不到的副作用。了解修饰核苷对生物系统的影响，对于RNA代谢标记至关重要。 修饰核苷如4-硫代尿苷（4-SUrd）和5-EUrd（图4D）广泛用于新生RNA的研究。然而4-SUrd在长时间暴露后会影响细胞存活率，并抑制rRNA的合成，这会显著影响分析中观察到的RNA数量。类似地，5-EUrd也被证明会随着长期暴露而降低细胞活力，并可能导致小鼠的神经退化。显然需要一种新的核苷，适合标记并对内源性系统的干扰最小。作者报道了乙烯基修饰核苷5-VUrd、2-VAdo和7-DVAdo用于RNA代谢标记，显著降低了细胞毒性。这是通过测量整体细胞代谢活性来确定的（图6A，B）。RNA测序还发现，与5-EUrd-fed细胞相比，5-VUrd细胞中RNA表达模式的变化很小。 图6 与5-EUrd相比，5-VUrd的细胞毒性更低 2. 尿嘧啶核碱基的非特异性掺入 如前所述，5-EU和4-SU等非天然碱基被纳入表达突变的弓形虫尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（TgUPRT）的细胞中。然而，有几份报告观察到修饰的碱基有显著的背景掺入。为了确定原因，作者研究了底物为尿嘧啶的人类UPRT（HsUPRT）和底物为乳清酸的人类尿苷单磷酸合成酶（HsUMPS）生成UMP的活性。作者分别在HEK293细胞中过表达这些酶，并在用5-EU进行RNA代谢标记后，从这些细胞中分离出总RNA。然后，通过铜催化叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）反应，将RNA生物素化，通过斑点杂交分析进行分析。作者观察到，与野生型细胞相比，5-EU与HsUPRT和HsUMPS表达细胞的结合增加，与HSUPT相比，HsUMPS过度表达的结合增加更大（图7B，D）。通过siRNA沉默这些基因后，作者观察到UPRT敲除细胞仍然能够结合5-EU，而UMPS敲除细胞没有表现出显著的结合（图7C，E）。这表明当用TgUPRT进行细胞特异性RNA代谢标记时，HsUMPS表达是人类细胞背景标记的主要来源。 图7 UPRT和UMPS表达对RNA代谢标记的影响 为了克服背景标记问题并提高RNA代谢标记中的细胞特异性，作者以“凹凸孔”的方式改变了TgUPRT酶，用侧链较小的氨基酸（即丙氨酸和/或甘氨酸）取代某些邻近的氨基酸，从而在活性位点上形成了一个“空穴”。设计了单、双和三个突变体，并将其瞬时转染到HEK293T细胞中。转染后，用修饰的碱基（5-EU、5-VU、5-叠氮甲基尿嘧啶或5-叠氮双唑（图8A）处理细胞，提取细胞RNA并进行生物素化，以通过斑点杂交分析尿嘧啶类似物的掺入（图8B）。作者发现三重突变型TgUPRT（M166A/A168G/Y228A）可以有效地将5-VU合并到RNA中（图8C）。通过MTT细胞代谢活性测定，研究了表达突变型TgUPRT的细胞与5VU处理的相容性，发现处理细胞与未处理细胞之间没有显著差异。通过这些结果，作者证明了通过使用5-VU和三重突变TgUPRT进行细胞特异性RNA代谢标记克服了野生型TgUPRT面临的非特异性结合挑战。 图8 细胞选择性5-VU掺入突变TgUPRT酶的筛选 新生RNA中修饰核苷酸的化学偶联 生物共轭既受生理条件下发生反应以实现生物分子最佳稳定性的需要限制，也受生物分子相对浓度低的限制。由于核糖上存在C-2′羟基，前一个限制对RNA修饰尤为重要。这个羟基可以作为亲核剂和磷酸二酯键的磷中心反应。由于这种键连接RNA中的核苷酸，这会裂解低聚物并破坏生物分子。这种RNA降解可以在多种条件下发生，例如pH值超出范围4-6、存在二价金属离子或高温。这些RNA化学反应的限制严重限制了RNA与荧光团等标记的共价修饰。在本节中，作者将讨论目前成功共价修饰RNA的方法。 1. 4-Surd的共价修饰 含硫非天然核苷4-SUrd具有高度亲核性，这使得诸如吡啶硫醇二硫化物（图9A）和甲硫磺酸盐（图9B）等亲电试剂可用于4-SUrd标记RNA的共价偶联。这些试剂通过硫醇交换反应与4-SUrd形成共价二硫键。另一种亲电标记试剂是碘乙酰胺，它使硫烷基化，并通过体外反转录分析用于跟踪4-SUrd并入RNA的情况（图9C）。或者，4-SUrd中的硫代羰基可以被间氯过氧苯甲酸或高碘酸钠氧化成硫酸盐，在亲核试剂（如胺）存在下作为离去基团（图9D）。这些用于RNA共价修饰的化学工具有一些缺点，包括二硫键的可逆性以及烷基化和氧化试剂的显著非靶向反应性。 图9 RNA代谢标记中修饰核苷的偶联策略 2. 炔烃和叠氮化物核苷的共价修饰 对于炔烃修饰核苷的偶联，如5-EUrd，最广泛使用的技术是CuAAC（图9E）。然而，铜可以促进RNA的非特异性降解，并在体内引起细胞毒性，这阻碍了此类反应在下游应用中的应用。叠氮化物的掺入为共价偶联提供了更好的机会，因为叠氮化物可以与环辛炔进行环张力诱导的叠氮化物-炔烃环加成（SPAAC），以及Staudinger连接等反应（图9F，G）。然而，这些方法也有局限性，包括环辛炔与内源硫醇的副反应和Staudinger反应所需的磷化氢试剂的氧化降解。 3. 乙烯基核苷的逆电子需求Diels–Alder反应 生物共轭中使用的另一类反应是逆电子需求Diels–Alder（IEDDA）反应。这些反应可以提供较高的产率，更快的动力学，而无需过渡金属催化剂。然而，由于内源酶可能无法耐受相对较大的变形烯烃，因此将这种变形烯烃并入RNA代谢标记具有挑战性。 由于哺乳动物细胞很容易将乙烯基核苷并入RNA，作者希望优化含乙烯基核苷酸RNA的IEDDA反应。该RNA中未激活的末端烯烃可能是二烯烃亲合物，因此作者试图确定在IEDDA反应中四嗪是否可以作为二烯烃。作者针对不对称四嗪库筛选出乙烯基核苷5-VUrd、7-DVAdo和2-VAdo（图10A）。Tz-1是与乙烯基核苷反应最活跃的四嗪，但分子的极低电子密度也使Tz-1在水介质中极易水解。 作者假设降低反应的pH值会限制四嗪水解（图10C），观察到与中性条件相比，添加10%乙酸后，Tz-1的水解显著减少（图10D）。与中性条件相比，7-DVAdo在弱酸性条件下与Tz-1的反应速率显著降低（图10E）。总的来说，作者优化了IEDDA反应，以提供一种无金属、RNA兼容的缀合策略。 图10 乙烯基核苷改性的IEDDA反应的发展 4. 乙烯基核苷的正交共轭 5-VUrd和2-VAdo可通过代谢标记并入细胞RNA。虽然两个核苷都含有末端烯烃，但这些烯烃的电子性质截然不同。2-VAdo中的烯烃高度离域，与腺嘌呤环的扩展共轭，是缺电子α，β-不饱和亚胺的一部分。相反，5-VUrd的末端烯烃与内部烯烃的离域作用有限，形成二烯。作者假设5-VUrd和2-VAdo在IEDDA反应之外具有正交反应性（图11A，B）。作者在重水中进行这些反应，并通过1H NMR波谱观察到这两种情况下的高转化率和快速反应。这些反应也是相互正交的：2-VAdo不作为二烯与马来酰亚胺反应，5-VUrd不作为Michael受体与TCEP反应。随后作者将这些反应用于5-VUrd和2-VAdo处理后从细胞中提取的生物素RNA，以通过斑点杂交法观察标记RNA的反应性。其中含有5-VUrd-的RNA与马来酰亚胺-生物素特异反应，而含有2-VAdo的RNA与TCEP特异反应（图11C）。这些反应不仅提供了无金属、RNA兼容的接合条件，而且还提供了同时使用两个乙烯基核苷进行RNA代谢标记的潜在方法。 图11 5-VUrd和2-VAdo的正交共轭 发现以前未知的RNA分子在生物系统中的功能作用是一个关键的研究领域，RNA代谢标记是研究RNA的重要工具。然而，这些技术必须具有低细胞毒性、高细胞类型特异性和RNA兼容的结合化学。作者发现了乙烯基核苷和碱基，用于在体外标记RNA，而没有观察到毒性。其开发的无金属、RNA兼容的共轭反应使RNA的共价修饰能够用于包括富集和荧光成像在内的应用，具有广阔的前景。 文章编号：102 原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.accounts.2c00347 原文引用： Mrityunjay Gupta, Samantha R. Levine, Robert C. Spitale*. Probing Nascent RNA with Metabolic Incorporation of Modified Nucleosides. Accounts of Chemical Research, 2022, 55:2647-2659. 
已知某些酶在底物范围内具有高度选择性，其蛋白质的三维结构可以区分底物中的细微结构差异。对于共转录RNA代谢标记，修饰核苷必须能被几种不同的酶接受为底物。因此，修饰底物的结构特征需要针对这些酶进行优化，以便成功进行RNA标记。特别是进行核苷初始磷酸化的核苷激酶具有高度选择性。因此，分析这些与天然底物结合的酶的晶体结构对于发现可能允许修饰底物中功能基团变化的开放空间至关重要。
1. 改性嘧啶核苷的细胞掺入
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