推荐一篇发表在JACS上的文章，题目为“Click Chemistry-Based Force Spectroscopy Revealed Enhanced Binding Dynamics of Phosphorylated HMGB1 to Cisplatin-DNA”，通讯作者是来自南京大学的郑鹏教授和郭子建院士，郑鹏教授的研究兴趣为利用单分子力谱研究金属蛋白，郭子建院士的主要研究兴趣为金属-生物大分子相互作用以及生物无机物种的荧光识别与检测。
顺铂通过共价结合DNA引发细胞死亡，从而实现肿瘤的治疗，然而，顺铂诱导的DNA损伤可以通过碱基切除途径修复，这限制了药物的疗效并导致耐药性。蛋白质HMGB1被发现可以与铂化的DNA（cisplatin-modified DNA, CP-DNA）结合，从而阻碍DNA损伤的修复，其相互作用机制的阐明对顺铂治疗具有重要的价值。之前的研究发现HMGB1可以在多个位点上发生磷酸化，可能影响其和顺铂-DNA复合物的亲和力，然而具体的磷酸化位点及其对相互作用的影响仍然是未知的。单分子力谱（single-molecule force spectroscopy, SMFS）是在分子水平上研究分子间和分子内相互作用的独特工具，然而，传统的将研究对象固定到原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）系统中的方法，如硫醇/马来酰亚胺或NH2/NHS反应等，可能影响到蛋白固有官能团，因此不是生物正交的，给精确量化分子相互作用带来了挑战。因此，作者采用了点击化学与酶连接结合的方式分别固定DNA和目标蛋白HMGB1。作者合成了一端连接了DBCO基团的CP-DNA。然后将其通过点击反应固定到叠氮包被的盖玻片上。对于HMGB1蛋白，先用马来酰亚胺基团对AFM探头进行功能化，然后通过Michael加成反应与重组蛋白GL-ELP40-ddFLN4-C进行反应，其中ddFLN4结构域在进行力谱研究时具有逐步展开的特性，形成独特的分子指纹用于识别单分子事件的发生。HMGB1的结构域A在其C端进行NGL序列工程化改造后，与探头末端的GL序列一起被OaAEP1连接酶识别并连接。基于此，作者首先测量了HMGB1结构域A与CP-DNA之间形成的复合物的解结合力。平均解结合力为116.2 ± 3.1 pN（平均±标准误差，n = 294），显著高于大多数天然DNA-蛋白质相互作用。作者通过分子动力学模拟，进一步分析了HMGB1与CP-DNA之间的强相互作用，并发现Phe37是介导相互作用的关键残基，这与之前的晶体学研究结论一致。接下来，作者合成了4个侧翼序列不同的CP-DNA突变体，用于研究HMGB1与CP-DNA结合的序列偏好性。结果表明，当N2碱基不变时，N1 = T的解结合力比N1 = C的解结合力要大，增加了30-50%。作者还发现HMGB1:CP-DNA复合物的解结合力略高于A:CP-DNA复合物，这表明A和B结构域都参与了CP-DNA的结合，其中A结构域是主要结合区域。作者还利用非天然氨基酸插入技术，将磷酸化的丝氨酸pSer插入到HMGB1蛋白中，构建了在不同位点进行磷酸化的HMGB1蛋白（pSer14, pSer34和pSer52），并研究了野生型HMGB1和每个磷酸化变体的两个关键动力学参数:自然解离率(koff)和配合物结合态与过渡态之间的距离(Δx)。作者发现pSer14的koff值为0.2 s−1，比野生型低35倍。分子动力学模拟也表明Ser14的磷酸化可以帮助形成额外的氢键，支持了这一观点。总之，作者通过结合点击化学和酶介导的连接在AFM系统中实现了各种HMGB1变体和CP-DNA序列的位点特异性固定，定量分析了HMGB1与顺铂修饰的DNA的结合强度。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c00224原文引用：DOI: 10.1021/jacs.4c00224
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