分享一篇近期发表在JACS上的研究进展，题为：A Method for Rigorously Selective Capture and Simultaneous Fluorescent Labeling of N‑Terminal Glycine Peptides。该工作的通讯作者是来自德克萨斯大学奥斯汀分校的Eric V. Anslyn。 对多肽或蛋白的氨基酸侧链或N端与C端的选择性标记是位点特异性生物偶联的核心内容，但现有偶联方法难以区分N端不同氨基酸残基的伯氨基。本文中，作者将研究聚焦在多肽N端甘氨酸（Gly）残基的选择性标记。在生物体内，N端Gly是一种蛋白酶体的降解靶点，用于清除细胞凋亡过程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）切割产生的多肽片段。此外，甘氨酸的修饰在合成高分子中也较为常见。因此，发展选择性N端Gly标记方法对多肽/蛋白和甘氨酸修饰材料的功能化至关重要。 Gly和其他氨基酸的区别是没有取代基，因此作者设想能否寻找合适的反应将Gly的亚甲基“双活化”，形成2根新的化学键，而其他氨基酸则因侧基的存在无法反应，最终实现对N端Gly的高选择性。那么，什么样的反应能“双活化”Gly的亚甲基呢？受胺与1,3-二酮的吡咯合成反应的启发，作者提出Gly可以和1,3-二酮发生如图1所示的多步反应，最终形成一个稳定的吡咯产物。 2,5-二苯基吡咯是一种已知的荧光基团，因此作者首先研究了二苯甲酰基甲烷（DBM-1）和甘氨酸甲酰胺（GMA）的模型小分子反应（图2）。筛选后的最佳反应条件为DMF溶剂130 ℃微波反应器反应5 h。最终作者成功以21%的产率分离得到了目标产物PY，并确证了它的结构。 在上述小分子模型反应的基础上，作者随后开展了多肽的标记实验。他们合成了六肽H2N-GAAYAA作为模型底物与DBM-1反应，其中Y（酪氨酸）的作用是为多肽提供UV信号便于HPLC分析（图3）。LC-MS和光谱表征支持成功得到了预期的Py-(G)AAYAA产物，修饰率为63%。图3. 模型小肽的反应。（a）反应式；（b）底物H2N-GAAYAA的吸收光谱；（c）产物Py-(G)AAYAA的吸收光谱；（d）275 nm紫外光作用下的发射光谱；（e）底物和产物在254 nm下的照片。 接下来，作者检验了上述标记方法对多肽链上其他氨基酸残基的兼容性，包括Lys(K)、Ser(S)、Gln(Q)、Glu(E)、Asp(D)、Met(M)和Cys(C)等（图4）。他们发现，除Cys外，其他氨基酸都是兼容的，而Cys用碘乙酰胺保护后也可兼容。其他氨基酸的α位伯胺和Lys侧基的伯胺在修饰过程中会转变为亚胺，但在酸性条件下可以将亚胺水解回到伯胺而不影响吡咯结构。即便Gly的相邻残基为大位阻的Tyr(Y)或Trp(W)也不会显著降低修饰效率。 最后，作者验证了上述方法在多肽混合物中选择性标记N端Gly多肽的能力（图5）。他们在DBM-1结构的基础上引入了TMS保护的炔基，以便于标记多肽的后续点击反应。然后，将大过量的DBM-2加入N端分别为G、F、V、W、L和Y的多肽的混合溶液中，按原条件反应。反应混合物在酸性水解后，仅N端Gly多肽被成功标记。为了将标记多肽从混合物中分离出来，作者选择加入叠氮修饰的树脂借助CuAAC反应将含炔的肽捕获。最终，将树脂上的肽切下，仅得到N端标记了吡咯的产物，证明了该方法对复杂混合物的分析能力。 综上，作者基于N端甘氨酸与1,3-二酮的吡咯生成反应实现了对复杂多肽混合物中含N端甘氨酸的多肽的选择性标记。 最后，我们将此方法与另外两种N端Gly选择性修饰方法做一个比较（图6）。Rai法（Nat. Commun. 2019, 10, 2539）和Kanemoto法（Angew. Chem., Int. Ed. 2024, 63, e202320012）的实现依赖于Gly较小的位阻带来的速率优势，因此延长反应时间可能会导致选择性的降低，而Anslyn法（本文）则是基于Gly的“双活化”策略，因此其他氨基酸无法转化为预期吡咯结构，具有高度的选择性。此外，三种方法的修饰效率和产物结构也各不相同，前两种转化率较高，在修饰后仍保留了胺的结构，便于后续其他修饰反；而Anslyn法虽转化率略低且反应条件剧烈，但一步到位将伯胺转化为了吡咯荧光基团，在多肽分析方面有着巨大的应用潜力。三种方法各有优劣，适用场景也各不相同，都是多肽选择性修饰的有益探索。DOI: 10.1021/jacs.4c04141Link: https://doi.org/10.1021/jacs.4c04141
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