分享一篇发表在Angew上的文章“A Bioorthogonal Dual Fluorogenic Probe for the Live-Cell Monitoring of Nutrient Uptake by Mammalian Cells”，通讯作者是莱顿大学的Sander van Kasteren教授，他们课题组主要利用化学工具研究早期免疫反应。这篇文章设计了一种可通过生物正交反应激活的荧光探针，用于研究细胞对代谢物分子的摄取。
免疫细胞在激活后可通过增加对营养物质的摄取用于细胞的合成代谢及供能，对这种摄取过程的研究可通过同位素或荧光标记等方式来实现，其中同位素标记的方式操作复杂且无法实现单细胞水平的观测，直接对代谢物进行荧光标记则往往影响了其本身的细胞摄取速率。本文作者此前开发了一种通过炔基-叠氮点击化学反应来对代谢物进行标记和成像的方法，但由于这种点击化学反应无法直接用于活细胞，需要对细胞进行事先的固定，因此本文中作者希望通过活细胞适用的逆电子需求的DA反应（IEDDA）进行标记和成像。作者以常用的荧光分子CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）为基础进行设计，CFSE结构中的两个乙酸酯可以增加其透膜性并同时保证只有荧光分子进入细胞内并被酯酶切割后才能具有荧光，NHS酯部分则能够通过与赖氨酸残基反应将荧光分子固定到蛋白上。作者通过在CFSE的结构基础上引入了四嗪基团，从而额外引入了一层激活机制，即只有四嗪与烯烃发生IEDDA反应后才能够激活荧光，进而实现对目标代谢物的成像。
作者对合成的荧光探针进行表征，使用猪肝酯酶处理后探针的荧光信号增强了6倍，在此基础上再加入TCO（反式环辛烯）则能够使荧光信号增强20倍，说明荧光探针能够按照预想中的方式被激活。随后作者构建了一个小型的含烯烃化合物库，包括TCO衍生的氨基酸，糖，以及环丙烯衍生的脂肪酸，谷氨酸等，测试发现TCO衍生物与探针均能够在25min内完成反应，环丙烯衍生物反应速率更慢，且环丙烯衍生的谷氨酸未能检测到反应发生。
后续作者将探针用于活细胞成像，将细胞首先用探针孵育半小时，洗去探针后再加入TCO衍生的代谢物并进行成像，作者发现相同条件下细胞对糖衍生物有最高的摄取量。作为实际应用，作者使用CD3和CD28激活T细胞，并随后加入TCO-氨基酸或环丙烯-脂肪酸来检测两种物质的摄取速率。他们发现只有在激活后的T细胞上检测到了更快的脂肪酸衍生物摄取，而氨基酸衍生物的摄取则在激活前后差别不大，作者推测可能由于苹果酸转运蛋白在激活后表达水平上升。总之，这篇文章通过设计一种可被生物正交代谢物激活的荧光探针，实现了活细胞水平上对生物正交代谢物的摄取速率进行检测。原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202401733文章引用：doi.org/10.1002/anie.202401733
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