分享一篇发表在JACS上的文章，题目为An Uncommon Phosphorylation Mode Regulates the Activity and Protein Interactions of N-Acetylglucosamine Kinase，通讯作者为德国莱布尼茨分子药学研究所/柏林洪堡大学的Dorothea Fiedler教授，该团队的研究兴趣为利用化学工具探究肌醇多磷酸、焦磷酸等物种对代谢信号的影响。
蛋白焦磷酸化是本世纪初发现的一种新型非酶促翻译后修饰。最近，作者团队开发了一套用于鉴定蛋白质组中焦磷酸化位点的质谱方法，并描绘了人源细胞系中的焦磷酸化修饰图谱（Nat Chem Biol. 2024, DOI: 10.1038/s41589-024-01613-5）。其中，作者将N-乙酰葡糖胺激酶（NAGK）的S76残基鉴定为焦磷酸化修饰位点，该蛋白在代谢中的关键功能也吸引了作者的兴趣：NAGK最为广为人知的功能是催化GlcNAc磷酸化产生GlcNAc-6-磷酸，从而参与GlcNAc的周转。NAGK的S76位点靠近其底物结合口袋，且是一个常见的磷酸化位点，然而该位点上焦磷酸化修饰对酶活性和其蛋白互作谱的影响还未被研究。本文中，作者通过化学半合成得到了位点特异、化学计量修饰的S76焦磷酸化NAGK（ppS76-NAGK）标准蛋白。如下图所示，首先，通过遗传密码子拓展技术在蛋白76位引入磷酸丝氨酸，随后，将得到的磷酸化蛋白（pS76-NAGK）与功能化的磷咪唑（P-imidazolide）试剂反应，该反应在将磷酸化位点焦磷酸化的同时，也引入了生物素标签（R）。在亲和纯化后，生物素标签可在365 nm光照下被脱除，从而释放出目标产物ppS76-NAGK。随后，作者比较了WT-NAGK、pS76-NAGK和ppS76-NAGK的活性。在两种典型反应（催化GlcNAc磷酸化和催化胞壁酰二肽（MDP）磷酸化）中，NAGK的活性都呈现出WT>p>pp，其中，S76焦磷酸化修饰使NAGK几乎失去了催化活性。鉴于S76上的磷酸化和焦磷酸化修饰显著影响了NAGK的活性，作者希望能够描绘NAGK S76发生磷酸化→焦磷酸化的生化过程。首先，作者验证了aurora激酶B是催化NAGK S76磷酸化的关键酶。随后，作者尝试找出pS76-NAGK焦磷酸化的磷酸供体。作为一种非酶促修饰，焦磷酸化的磷酸供体通常被认为是肌醇焦磷酸代谢产物（PP-InsPs），然而，当作者使用几种典型的PP-InsPs处理pS76-NAGK后，并未观察到焦磷酸化产物的生成。作者将注意转向细胞内其他高能磷酸物种，有趣的是，当换用ATP处理pS76-NAGK后，得到了位点特异性的焦磷酸化产物ppS76-NAGK。基于上述结果，作者认为NAGK的S76焦磷酸化不是由PP-InsPs所介导的，而是以ATP依赖的自催化方式产生的。随后，作者探究了这种焦磷酸化修饰是否能被去磷酸化反应所去除。作者用HEK293T细胞裂解物分别处理了pS76-NAGK和ppS76-NAGK，结果显示，细胞裂解物中的磷酸酶能去除单磷酸化修饰，而不能去除焦磷酸化修饰。最后，作者探究了S76上焦磷酸化修饰对NAGK蛋白互作谱的影响。作者向HEK293T细胞裂解物中分别掺入带有His标签的WT-NAGK和ppS76-NAGK，经孵育、富集后，利用定量蛋白质组学分析被富集的相互作用蛋白。结果显示ppS76-NAGK失去了与一些典型的NAGK相互作用蛋白结合的能力，同时也具有了一些新的互作伙伴。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03069文章引用：DOI: 10.1021/jacs.4c03069
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