介绍一篇发表在JACS Au上的文章，文章的标题是“A “One-Step” Strategy for the Global Characterization of Core-Fucosylated Glycoproteome”，通讯作者是来自中科院上海药物所的周虎研究员、文留青研究员，以及文留青课题组的田银平助理研究员，前两者的研究方向分别是基于质谱的药物蛋白质组学、基于寡糖的药物研究和新药靶点发现。
蛋白质糖基化是最普遍和最复杂的翻译后修饰之一，参与各种生命过程。核心岩藻糖基化是一种特殊类型的N-连接糖基化，是岩藻糖通过α1,6-糖苷键与N-聚糖最内层的GlcNAc连接的一种修饰，其形成由唯一的酶FUT8催化。核心岩藻糖基化已被证明在肿瘤增殖、转移和治疗抵抗等方面非常重要。因此，发展识别和定量异常的核心岩藻糖基化的方法对于发现新的药物靶点及用于诊断的生物标志物是必要的。由于糖基化肽段的丰度低、电离效率差，直接检测核心岩藻糖基化位点是非常困难的，需要从复杂的混合物中将核心岩藻糖基化肽段富集出来。此前，作者报道了两种富集的策略。一是使用生物素化的恶唑啉探针，首先通过核苷外切酶EndoF3将Asn连接的N-聚糖从含有核心岩藻糖基化的GlcNAc位点处切断，再使用EndoF3的D165A突变体作为糖苷合成酶，将带有生物素基团的探针连接到糖肽上，经链霉亲和素富集后再次将探针片段切去，进行质谱分析。通过这一策略，作者实现对细胞表面的岩藻糖基化蛋白的检测(Angew, 2022)。但对于细胞裂解液的标记，由于恶唑啉探针的非特异性标记较强，生物素化探针与糖肽的极性相似难以分离，且链霉亲和素树脂用量大，这一方法并不适用。因此，作者将富集试剂换为温度敏感的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，PNIPAM在低于40 °C时是水溶性的，高于40 °C则会沉淀。利用这一特性，核心岩藻糖基化的肽段在标记上叠氮基团后，通过Click反应连接PNIPAM，在40 °C下PNIPAM沉淀，通过简单的离心就可以将目标糖肽富集出来(JACS, 2023)。但这种“两步法”的策略会受到化学反应效率的限制，在本文中，作者希望通过“一步法”的反应实现对目标糖肽的富集，他们的方法是直接合成带有PNIPAM基团的探针。首先，作者使用标准肽测试了EndoF3和EndoF3-D165A对探针的兼容性，并与“两步法”的策略比较，LC-MS的分析显示，两种方法都能够有效地将糖肽从混合物中分离出来，“一步法”显示出更好的富集效果，峰面积大约是“两步法”的1.9倍。进一步的LC-MS/MS分析也证明，“一步法”的策略能够提供糖基化位点的信息。接下来，作者将这一策略运用于人类肝癌细胞系H1299中核心岩藻糖基化位点的分析。他们共鉴定到652个蛋白上的1200个位点，与“两步法”相比具有更好的覆盖度。这些蛋白中大约有9%具有四个及以上的核心岩藻糖基化位点。蛋白质互作网络的分析显示，这些蛋白主要与细胞黏着、迁移，膜和外泌体的成分，以及整合素结合与信号受体活性等生命过程相关。最后，作者对人类肺腺癌(LUAD)相关的异常核心岩藻糖基化位点进行鉴定。与正常邻近组织(NAT)相比，肿瘤组织中核心岩藻糖基化的水平明显升高，其中包含196个表达上调与6个表达下调的位点，KEGG分析显示这些位点与ECM-受体相互作用、黏着斑、PI3K-Akt信号通路等重要的生理过程相关。总之，作者发展了用于全局分析核心岩藻糖基化的“一步法”策略。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00214文章引用：https://doi.org/10.1021/jacsau.4c00214
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