推荐一篇发表在Nature Biotechnology的文章，文章的题目为“Linking CRISPR–Cas9 double-strand break profiles to gene editing precision with BreakTag”，文章的通讯作者为德国分子生物学研究所Vassilis Roukos教授和Petra Beli教授。其中Vassilis Roukos教授的研究方向为DNA复制，损伤和修复，Petra Beli教授的研究方向集中在发育生物学、表观遗传学和基因组稳定性等领域。CRISPR-Cas9作为可编程的基因组编辑工具，目前已经得到了广泛应用。CRISPR-Cas9介导的DNA编辑最初被认为会导致随机插入和缺失，然而近来研究表明，Cas9诱导DNA断裂的修复不是随机的，而与目标位点的序列环境密切相关。为了探索背后的具体机制，作者开发了BreakTag方法，用于分析Cas9导致的DNA双链断裂（DSBs），并识别Cas9切口的决定因素。首先作者对Cas9编辑的DNA进行末端修复，加A尾处理，后续连接接头进行Tn5转座酶标记，最后通过pcr扩增测序。基于BreakTag技术，作者在3500个sgRNAs靶向的约15万个内源性位点上进行表征，发现SpCas9 引起了35%左右位点的错位切割。其中错配存在显著提升了错位切割比例，且原间隔区序列特定位置的碱基组成对错位切割有重要影响。此外，作者发现错位切割与精确的单碱基插入有关，而钝端切割更多产生删除修复或随机插入。错位端具有单链悬突，因此在修复过程中更容易通过模板依赖的机制引入精确的单碱基插入。后续，作者发现不同的Cas9变体在切割结构上表现出显著差异。LZ3导致了更多的错位切割，这表明LZ3可能是引入高频插入的有力工具。最后，作者设计机器学习模型，筛选出致病性的单核苷酸缺失，并预测目标位点的Cas9切割特征。错位切割导致的单碱基插入在回复原始蛋白序列方面具有显著优势。因此基于断裂模式的gRNA和Cas9变体设计可以用于纠正临床相关的致病性单核苷酸缺失。总之，作者开发了BreakTag方法，对CRISPR-Cas9介导的双链断裂模式和基因编辑效果的关系进行了细致的研究，为单核苷酸缺失疾病提出了潜在的治疗策略。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02238-8原文引用：DOI：10.1038/s41587-024-02238-8
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