供稿：侯雨辰，北京大学

   为大家推荐一篇发表在 ACS Chemical Biology 上的文章，文章标题为“O-GlcNAcylation Quantification of Certain Protein by the Proximity Ligation Assay and Clostridium perfringen OGA^D298N (CpOGA^D298N )”。文章通讯作者是来自武汉大学生命科学学院的孙慧教授。孙慧教授课题组的主要研究领域为糖生物学研究工具和方法的开发，以及糖基化修饰与相关疾病的研究。本文中，作者发现产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen) OGA^D298N 对末端 O-GlcNAc 表现出了高度的特异性识别能力，能够有效区分结构相似的 GlcNAc 与 GalNAc，并表现出了优于目前广泛使用的抗体 CTD110.6 和数种凝集素的选择性富集能力。随后作者又将 CpOGA^D298N 与邻近连接技术(PLA)相结合，设计了一种针对 O-GlcNAc 修饰蛋白的定量方法。 

O-GlcNAc 糖基化修饰是一种在细胞内广泛存在的蛋白质翻译后修饰类型，主要发生在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上，并在蛋白质转录、营养感知、细胞分化与周期调控等生命过程中扮演着关键的角色。自上世纪 80 年代首次发现至今，已有 4000 余种 O-GlcNAc 修饰糖蛋白被成功鉴定和报导。尽管这一翻译后修饰类型具有十分重要的生物学功能，由于 O-GlcNAc 修饰自身具有稳定性差、丰度低、不带电荷等特点，目前仍缺乏对于 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的高效、高选择性富集与定量分析手段。因发生 O-GlcNAc 修饰的表位通常是免疫系统耐受的自身抗原，已开发的泛 O-GlcNAc 糖基化抗体（CTD110.6、RL2 等）常表现出较弱的亲和力，且不同的抗体往往具有不同的肽段序列偏好性。此外，现有的富集手段（如抗体、凝集素、HILIC 等）几乎都难以将结构高度相似的 GalNAc 与 GlcNAc 进行有效区分，这些因素都使得目前对于单蛋白或蛋白质组水平 O-GlcNAc 糖基化修饰的鉴定分析仍存在着巨大的挑战。 

此前的研究中，已有研究者报导将 CpOGA^D298N 应用于 O-GlcNAc 糖基化蛋白的富集与鉴定，但仍缺乏对于这一相互作用过程中选择性与特异性的相关研究数据。为弥补这一空白，本文作者通过聚糖阵列法分析比对了 CpOGA^D298N 与 O-GlcNAc 商业抗体 CTD110.6 以及数种被报导用于鉴定 O-GlcNAc 修饰的凝集素与不同末端聚糖的结合能力，而 CpOGA^D298N 在其中表现出了最佳的 O-GlcNAc 结合特异性。随后，作者发现 CpOGA^D298N 能够的有效区分 GlcNAc 与 GalNAc（图1），进一步证明了 CpOGA^D298N 相较其他已有 O-GlcNAc 富集和鉴定手段在特异性上有着显著的优势，有助于研究者获取更为精确的 O-GlcNAc 修饰信息。

图 1. CpOGA^D298N 能够对 GlcNAc 和 GalNAc 进行有效的区分。 

(A) CpOGA^D298N 、CTD110.6 和 WGA 的聚糖阵列数据的热图分析；(B) CpOGA^D298N 、CTD110.6 和 WGA 的聚糖阵列数据的散点图，其中不同形状表示聚糖结构中的不同单糖：蓝色方块代表 GlcNAc，绿色圆圈代表甘露糖，黄色环代表半乳糖，紫色菱形代 Neu5Ac，红色三角形代表岩藻糖；(C) 25 °C 下 CpOGA^D298N (25 μM)和 GlcNAc/GalNAc 单糖(3 mM)在 0.01 M PBS 缓冲液 (pH 7.4)中的等温滴定量热法(ITC)分析。

为进一步评价 CpOGA^D298N 在 O-GlcNAc 糖基化蛋白识别中的应用前景，作者同时将 CpOGA^D298N 与抗体 CTD110.6 应用于 6 种小鼠器官样本的免疫印迹研究(图2，A)。实验结果表明，在全部样本中 CpOGA^D298N 相较 CTD110.6 都能鉴定到更多的 O-GlcNAc 糖基化蛋白条带，且 CpOGA^D298N 对 O-GlcNAc 糖基化蛋白的相互作用能被外源的游离 GlcNAc 有效竞争抑制。随后作者又将 CpOGA^D298N 应用于 4 种癌细胞系中 O-GlcNAc 糖基化蛋白的原位免疫荧光成像（图2，C）。作者将与生物素偶联的 CpOGA^D298N 对通透化处理的细胞进行孵育，从而成功地标记了四种细胞系核与胞质中存在的 O-GlcNAc 糖基化蛋白，且这一荧光标记能被外源 GlcNAc 有效竞争抑制。

图 2. CpOGA^D298N 应用于 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的免疫印迹法分析与原位免疫荧光成像分析。 

(A) CpOGA^D298N 、CTD110.6 分别对 6 种小鼠器官组织样本的 O-GlcNAc 水平进行检测，而外源 GlcNAc 的加入可以有效抑制信号；(B) 4 种细胞的流式细胞术分析：未经任何预处理时(上图)；通透化处理后(下图)，经通透化处理后细胞即使在低浓度(0.1 μM)下也可以被 CpOGA^D298N 染色，且染色过程可被外源 GlcNAc 有效抑制；(C) 使用生物素化的 CpOGA^D298N 对 4 种细胞进行免疫荧光分析。

随后，作者又成功地将CpOGA^D298N 应用于 7 种哺乳动物细胞系及小鼠肝脏组织样本中 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的富集与鉴定（图3, A），证明 CpOGA^D298N 能够在实际样本中高效的富集到 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白。基于此，作者设计了通过 CpOGA^D298N 富集与高浓度 GlcNAc（20mM）选择性竞争洗脱对实际样品中 O-GlcNAc 修饰蛋白/肽段进行特异性富集的实验流程（图3, B）。最终，本文成功地在 MCF-7 细胞系中鉴定到了 84 种 O-GlcNAc 修饰肽段（82 种 O-GlcNAc 修饰糖蛋白），并在小鼠肝脏组织样本中鉴定到了 33 种 O-GlcNAc 修饰肽段（33 种 O-GlcNAc 修饰糖蛋白）。

图 3. 利用 CpOGA^D298N  对不同细胞系和小鼠肝脏组织样本中 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白进行富集。

 (A) CpOGA^D298N 、CTD110.6 分别对经/未经 CpOGA^D298N 磁珠富集的 8 种裂解液进行免疫印迹分析；(B) 富集和鉴定 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的流程示意图；(C) 全实验流程中 HPLC 的光谱吸收变化；(D) 通过 UniProtKB 富集到的 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白进行亚细胞定位分析；(E) 所富集到的 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的功能注释分析。

最后，本文作者结合 CpOGA^D298N 与邻近连接分析（PLA）建立了一种全新的 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白定量方法来实现低丰度 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的定量分析研究。在 CpOGA^D298N-PLA 中，分别偶联在 CpOGA^D298N 和蛋白抗体上的两段 ssDNA 因空间上的靠近而被连接酶链接，并在引物存在和聚合酶催化下发生扩增，依据扩增时产生的实时 PCR 信号即可得到 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的定量信息。此外，作者通过蛋白抗体-PLA 和 CpOGA^D298N-PLA 两组实验分别获得某一特定蛋白质的总量和带有 O-GlcNAc 修饰的该蛋白总量，将两组数据相比较即可得到某一特定蛋白中发生 O-GlcNAc 糖基化修饰的比例。因无需对 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白进行任何复杂的预处理，基于 CpOGA^D298N-PLA 的定量方法与其他已有的定量方法相比显得更为便捷，然而某些能够与 CpOGA^D298N 发生相互作用的非 O-GlcNAc 修饰蛋白可能在定量过程中产生假阳性信号响应。

图 4. 结合 CpOGA^D298N 与邻近连接分析(PLA)建立的 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白定量方法示意图。 

(a) 蛋白质与 ssDNA 的偶联方法；(b) CpOGA^D298N -PLA：针对单 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的定量流程示意图；(c) 蛋白抗体-PLA：针对单蛋白的定量流程示意图。

综上，本文作者系统地比较了 CpOGA^D298N 与泛 O-GlcNAc 糖基化修饰抗体 CTD110.6 和数种已报道的凝集素对于 O-GlcNAc 糖基化修饰的选择性。结果表明，CpOGA^D298N 不仅在与 O-GlcNAc 的相互作用中表现出了良好的特异性，也能够高效的分辨其他方法难以区分的 GlcNAc 与 GalNAc。随后作者又将 CpOGA^D298N 成功应用于 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的免疫印迹检测、原位荧光成像以及选择性富集，并建立了一种结合 CpOGA^D298N 与 PLA 的低丰度 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白定量分析方法，这些工作无疑对 O-GlcNAc 糖基化修饰蛋白的富集与分析研究有着十分重要的意义。

ACS Chem. Biol. 2021, DOI:10.1021/acschembio.1c00185

Publication Date: June 9, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00185

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