近日，南方科技大学王杰课题组在J. Am. Chem. Soc.杂志上发表了题为“Genetically Encoded Epoxide Warhead for Precise and Versatile Covalent Targeting of Proteins”的论文。在这项工作中，作者开发了全新的带有环氧乙烷结构的非天然氨基酸（EPOY），用于介导蛋白-蛋白互作界面间的化学交联，实现了一个活性反应基团对多达10种天然氨基酸侧链(H，M，C，K，D，E，Y，S，T，R)的广谱邻近交联（图1）。基于邻近交联的互作匹配（binding match）和化学匹配（reactivity match）的双重选择性，作者通过对KRAS蛋白的His-95残基的共价靶向，在实现了对各种不同KRAS致癌突变体（G12-C/D/V/A/R/S, G13-C/D, Q61H）的广谱性共价交联的同时，实现了对KRAS、NRAS和HRAS的选择性共价靶向，为新一代pan-KRAS共价抑制剂（共价靶向His-95）的开发提供有力的指引。图1 EPOY非天然氨基酸及介导共价交联反应示意图近年来，共价药物分子因其独特的药代动力学和药效机制而被科学家们重视和关注。其中Bortezomib、ibrutinib、gefitinib等共价抑制剂相继成功开发让共价药物站在了新药开发的潮头，KRAS-G12C的共价抑制剂Sotorasib的出现更是终结了KRAS这一重要靶点长达30年不可成药的历史。共价靶向的策略可以显著延长药物-靶标有效作用时间，使半衰期较短的分子也可以通过共价靶向的方式与靶标蛋白形成长效作用。并且共价靶向的策略可以实现药物分子在靶标上的不可逆累积，实现较低亲和力分子对高亲和力分子的竞争逆转。受启发于共价小分子抑制剂，共价蛋白药物是近年来新兴的蛋白药物概念。尤其是对于小蛋白药物而言，例如纳米抗体、细胞因子等，通过共价的策略可以显著延长其与靶点蛋白的作用时长，改善其药代和药效动力学，提高成药可能性。此外，由于共价蛋白药物通过邻近作用起效，所以必须同时进行正确的药物--靶标“互作匹配”（binding match）以及“化学匹配”（reactivity match）才能与靶标形成共价键，这种双重匹配的机制进一步提高了靶向药物的特异性和目标选择性，大大降低脱靶风险。在过去的研究中，已经有非天然氨基酸被开发用于介导蛋白-蛋白互作界面的化学交联。例如基于乙烯基磺酰胺基的VSF、pNCSF和基于丙烯酰胺官能团的AcrK、AcrF，基于卤素的BrC6K、FPheK，以及基于磺酰氟官能团的非天然氨基酸FSY、FSK等。然而，大多数共价交联基团面临交联效率低以及稳定性不足等问题。磺酰氟结构在一定程度上解决了交联效率和稳定性的问题，基于六价硫氟交换反应的FSY非天然氨基酸因具备较好的生物正交性、稳定性和较高的交联效率，使得共价蛋白药物得到了快速的发展，并在后续的研究中被广泛用来开发共价型的CAR-T，共价型的膜蛋白降解剂和共价型的细胞因子。但磺酰氟结构所能共价靶向的天然氨基酸残基种类有限，仅能共价靶向少数几种氨基酸侧链（H, K, Y）。考虑到蛋白质相互作用界面上的氨基酸种类繁多，其他具备亲核性的氨基酸侧链暂时未能实现共价靶向，这也在一定程度上限制了共价蛋白药物的发展。因此，开发可遗传编码、生物相容性好、邻近交联反应范围广的共价反应基团，是发展共价蛋白药物的关键。基于这一标准，作者把目光转向了环氧乙烷结构。环氧乙烷是一种相对稳定和安全的官能团，美国食品与药物管理局（FDA）批准的几种药物的结构中都含有环氧乙烷结构，这证明了它在生理条件下的稳定性和安全性（图2）。此外，环氧乙烷还是一种高活性官能团，具备与各类氨基酸侧链的亲核基团发生反应的潜力；同时，环氧乙烷的化学反应活性可通过三元环上的取代基进行微调。因此，环氧乙烷结构具备了活体稳定性、广谱反应性和反应性可调的特点，有望成为共价蛋白交联的理想官能团。
在此项研究工作中，作者设计并开发了携带有环氧乙烷共价反应基团的非天然氨基酸EPOY。根据交联臂长以及环氧反应活性的可调性，作者设计合成了三种EPOY（图3）并通过定向进化分别得到了可以识别三种EPOY氨基酸的氨酰tRNA合成酶（EPOY-RS），实现了对三种EPOY非天然氨基酸的遗传编码，可以将基于环氧乙烷的共价反应基团引入到目标蛋白的特定位点。图4 环氧乙烷酪氨酸（EPOY3）的邻近化学交联反应性研究随后，作者在免疫检查点PD-L1和纳米抗体KN035中测试验证了EPOY介导蛋白-蛋白互作界面共价交联的能力。作者将EPOY3定点插入纳米抗体KN035的L108位，并将PD-L1的69位H突变为9种其它具有亲核能力的氨基酸，同时构建H69A作为负对照，作者发现环氧乙烷可以与全部10种氨基酸残基发生共价交联且不与H69A突变体发生反应，这表明环氧乙烷可以精准介导纳米抗体KN035与PD-L1蛋白发生位点特异性的共价交联。作为对照，FSY在相同的相互作用界面和位点，仅能交联3种氨基酸侧链。在随后的研究中，作者基于可遗传编码的环氧乙烷酪氨酸（EPOY）设计了可以广谱性共价靶向KRAS致癌突变的泛KRAS共价结合蛋白，同时利用环氧乙烷对氨基酸侧链的化学选择性，实现了对KRAS、NRAS和HRAS选择性共价靶向。KRAS蛋白的突变是许多癌症中的关键驱动因素，针对KRAS的药物开发长期以来一直面临挑战。KRAS-G12C突变体的共价抑制剂的成功，促进了其他KRAS突变抑制剂的快速发展。在最近的研究中，针对KRAS的G12D、G12R、G12S等突变也实现了共价靶向。然而，KRAS的其他多种致癌突变，如G12V、G12A和G13D，目前还缺乏有效的共价靶向方法，同时，共价靶向KRAS-SWITCH Ⅱ附近的致癌突变，其所开发的小分子抑制剂极易产生耐药性，因此发展一种能同时抑制KRAS多种致癌突变的泛抑制策略显得尤为重要（图5）。作者认为要实现这样的目标，需要靶向KRAS的特定表位。该表位的空间构象应当保持恒定，不受KRAS致癌突变的影响，也即不同的KRAS突变体之间蛋白构象重叠的较好的区域，这样的表位才具备泛KRAS靶向的结构基础。而这又带来另一个问题，KRAS的同源蛋白HRAS/NRAS与KRAS在序列和结构上高度类似，KRAS的构象不受致癌突变影响区域，恰好也是K/N/H-RAS构象高度重叠的区域。如果靶向此区域（表位），在抑制KRAS的同时，也会抑制NRAS和HRAS的功能，这将带来严重的副作用。因而，如何实现对不同KRAS突变体广谱靶向的同时，实现对KRAS和HRAS/NRAS的精确区分是一个巨大的挑战（图5）。作者对9种KRAS不同突变体的晶体结构进行对比，发现KRAS-H95所在的第三螺旋（86-110）结构的构象在不同的突变体结构相对保持恒定，是理想的pan-KRAS靶向的结构区域，为开发泛KRAS结合剂提供了可能。同时，通过对KRAS、HRAS、NRAS进行序列比对，作者发现在第三螺旋的95位和107位，KRAS拥有区别于HRAS、NRAS的氨基酸侧链（图5）。对于95位，KRAS上是组氨酸（H），NRAS上的是亮氨酸（L），HRAS上的是谷氨酰胺（Q），NRAS和HRAS上95号位的两种残基均不具备反应性，靶向H95残基可以实现K/N/H-RAS之间的选择性。类似地，对于107位，KRAS、NRAS和HRAS上的分别是谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）和天冬氨酸（D）。尽管它们的侧链都含有相同的反应基团（羧基），但天冬氨酸的侧链比谷氨酸短一个碳原子，由于空间位阻和距离的原因，同样有可能产生K/N/H-RAS之间的选择性（图5）。图6 共价靶向H95实现对KRAS、HRAS/NRAS选择性基于上述分析设计，作者选择了可以靶向KRAS这一区域的结合蛋白DARPin-K13。DARPin是一类特殊的支架蛋白，通过改变结合界面的氨基酸和定向进化，DARPin可以与不同的目标蛋白结合，而DARPin-K13是通过噬菌体展示技术筛选到的KRAS结合蛋白。作者围绕KRAS-H95和E107作为共价靶向目标，通过遗传密码子扩展技术将环氧乙烷结构引入DARPin-K13和KRAS蛋白的互作界面，并对EPOY3的插入位点进行了系统性的筛选。作者发现将环氧乙烷引入DARPin-K13的W35位可以共价交联KRAS-H95，将环氧乙烷引入DARPin-K13的K133位可以共价交联KRAS-E107。作者测试了在W35位点引入EPOY3后，DARPin-K13对于KRAS和HRAS与NRAS之间的选择性。作者分别利用表达有KRAS、HRAS和NRAS的细胞裂解液与DARPin-K13进行孵育，结果显示DARPin-K13仅交联KRAS，而HRAS和NRAS不会与DARPin发生交联，这表明共价靶向KRAS-H95和E107均可以实现对KRAS与HRAS/NRAS的选择性（图6）。随后作者测试了肿瘤中突变频率最高的KRAS前10种突变体，将过表达有不同突变体的细胞裂解液与DARPin-K13-W35-EPOY3孵育，结果表明DARPin-K13-W35-EPOY3可以与其中9种发生共价反应（图7），突变率覆盖度高达85%以上，证明了共价靶向H95可以实现对KRAS致癌突变体的广谱靶向。总之，在本文中，作者通过开发一种全新的环氧乙烷结构的非天然氨基酸，在蛋白互作界面实现对多种天然氨基酸侧链的广谱邻近交联。通过共价靶向KRAS的H95位，作者成功发展了一种KRAS蛋白的选择性泛抑制策略，不仅可以实现对各种不同KRAS致癌突变体的广谱性共价靶向，还可以在K/N/H-RAS之间产生很好的选择性，为新一代KRAS共价抑制剂的开发提供有力的参考。本文的通讯作者为南方科技大学化学系王杰副教授。南方科技大学化学系2023级博士张金鹏、2022级博士生王霞和研究助理黄清俊为本文的共同第一作者，2021级硕士生叶锦松亦为本研究做出了贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点研发计划、北京分子科学国家研究中心、深圳市科创委、深圳市医学科院等项目的支持。原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03974
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