给大家推荐一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，文章标题是Structure–Activity Relationship of Metabolic Sialic Acid Inhibitors and Labeling Reagents。其通讯作者是荷兰拉德堡德奈梅亨大学分子化学系的Thomas J. Boltje教授。Thomas J. Boltje教授旨在利用化学和化学生物学工具理解复杂聚糖在人类健康和疾病中的作用。在本文中，作者合成了在C-4、C-5、C-8和C-9位有修饰的3-氟唾液酸衍生物并在体外测试了它们的抑制能力。与天然的乙酰胺基相比，在C-5位的修饰导致抑制增强。同时这些结构-活性关系也可以通过在C-5位的修饰被应用于提高唾液酸代谢标记试剂的效率上。因此，这些结果提高了我们对唾液酸类似物的构效关系及它们的代谢过程的认识。

唾液酸在哺乳动物的膜结合和分泌的糖蛋白和糖脂的聚糖末端大量表达，唾液酸家族含有多于80个结构不同的成员。哺乳动物细胞可以通过从N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc) 开始的从头生物合成途径在三步酶促反应中产生唾液酸。之后，唾液酸通过CMP-唾液酸合酶 (CMAS) 转化为CMP-唾液酸。CMP-唾液酸被转运到高尔基体囊泡中，作为20个唾液酸转移酶同工酶的供体，这些糖转酶通过不同的糖苷键 (α2-3, α2-6和α2-8) 在各种糖缀合物 (N / O-聚糖, 糖脂) 上连接唾液酸，从而产生唾液酸化聚糖。细胞表面唾液酸是无数生物过程的重要调节剂，如离子的结合和运输、增强粘蛋白的粘性、调节糖蛋白半衰期以及与唾液酸结合蛋白相互作用。

各种起源的癌症均显示出细胞表面糖基化的改变，唾液酸过表达是一个常见的特征。唾液酸在癌症中的过表达源于唾液酸途径代谢通量增加、唾液酸转移酶表达增加及唾液酸酶表达降低。癌症高唾液酸化与对放化疗的抗性、癌症发展、转移以及免疫抑制性肿瘤微环境的诱导有关，从而导致侵袭性癌症预后不良。因此，阻断癌症中的异常唾液酸化可能代表一种有希望的治疗策略。细菌唾液酸酶已进入临床试验以减少癌症唾液酸化，尽管成功有限。细菌唾液酸酶有经常被污染、免疫原性、在水解后保持结合、作用短暂等问题。另一种策略依赖于使用唾液酸化聚糖生物合成中的小分子抑制剂。Paulson等人报道了一种基于过乙酰化3-氟唾液酸 (P-SiaFNAc) 的细胞渗透性唾液酸化代谢抑制剂。进入细胞后，P-SiaFNAc通过酯酶脱乙酰化，SiaFNAc通过CMAS转化为CMP-SiaFNAc。CMP-SiaFNAc已被证明可以作为唾液酸转移酶的竞争性抑制剂，并导致对从头生物合成途径的反馈抑制。P-SiaFNAc抑制唾液酸化具有癌细胞的高特异性，导致肿瘤生长和转移减少。P-SiaFNAc的使用也有助于理解去唾液酸化如何导致免疫反应的增强。通过利用唾液酸C-5位的底物耐受性，作者最近开发了更有效的P-SiaFNAc类似物。结果发现P-SiaFNAc的C-5位氨基甲酸酯衍生物在体外显著增强了抑制活性。此外，作者报道了类似差异存在于含有C-5位炔丙酰氧羰基 (Poc) 的唾液酸与叠氮基乙酰 (Az) 衍生物。

为了进一步研究非天然修饰的影响，本文报告了C-4、C-5、C-8和C-9修饰的 (3-氟) 唾液酸类似物的合成和生物学评估。这些衍生物可以被动扩散进入细胞，并通过唾液酸代谢途径进行处理 (如图1)。结果显示C-5衍生物的抑制能力排序如下：氨基甲酸酯 > S-硫代氨基甲酸酯 > 硫脲 > 尿素 > 酰胺。结果表明，非天然类似物的代谢具有明显的结构-活性关系，导致比P-SiaFNAc母体化合物更有效的抑制能力。同时，该结果也可以转化为提高唾液酸代谢标记试剂的能力，C-5丙炔氨基甲酸酯可以实现更有效的代谢标记。

图1 代谢唾液酸化抑制剂和代谢标记试剂的结构和作用方式

首先，探究代谢唾液酸抑制剂的结构-活性关系。

为了能够直接比较不同的C-5衍生物，制备了两组含有相同饱和 [乙基, 2, 4, 6, 8, 10, 12 (叠氮代乙基) ] 或不饱和 (炔丙基, 3, 5, 7, 9, 11) 链长的衍生物。之前文献报道，在C-5 (氨基甲酸酯 vs 酰胺) 处引入杂原子导致CMAS增加代谢处理，从而增加相应活性CMP衍生物的细胞内浓度。因此，我们以C-5酰胺 (a)-、氨基甲酸酯 (oc)-、尿素 (u)-、硫脲 (tur)-和含S-硫代氨基甲酸酯 (tc) 化合物研究了各种杂原子取代模式，以确定它们对抑制能力的影响。P-SiaFNAc衍生物2-12通过酰化从相应的C-5胺制备，低至中等产量为7-44% (图式1)。在C-3氟存在下，C-5胺的反应不能有效地进行，可能是由于胺的亲核性较低。

图式1 SiaF衍生物2-12的合成

在人THP-1单核白血病细胞上测试抑制剂2-12的效力 (图2)。评估抑制剂效力的方法为将细胞孵育在一系列抑制剂浓度3天以允许唾液酸化聚糖调整。3天后，通过使用MAL-II凝集素染色α2-3-唾液酸来测量细胞唾液酸化。EC₅₀值被定义为与对照组 (DMSO) 相比凝集素结合降低50%的浓度 (见图2)。除3和11外，所有合成的唾液酸苷都比P-SiaFNAc抑制更有效。这与早期的研究吻合，氨基甲酸酯组能够通过CMAS增加代谢处理。与P-SiaFNAc相比，具有S-硫代氨基甲酸酯、尿素或硫脲的抑制剂也显示出更高的抑制效力。对于这两系列化合物 (乙基和丙炔基)出现了一种趋势，氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯连接是最强的，其次是硫脲，然后是尿素，酰胺衍生物是最无效的抑制剂。丙炔硫代氨基甲酸酯11在相对较低的浓度下显示出毒性。为了验证这一趋势，在更广泛的细胞系中测试了抑制剂的活性：Jurkat急性T淋巴细胞白血病细胞、小鼠EL-4 (T淋巴细胞白血病)、GL261 (胶质瘤)和B16F10 (黑色素瘤) 癌细胞系。

图2 SiaF衍生物对α2-3-唾液酸抑制存在剂量依赖

由于用MAL-II染色会导致与3-O-硫酸化半乳糖残基的不必要结合，因此我们切换到SNA-I，它结合α2-6-唾液酸。唾液酸化在不同浓度的抑制剂下测得，同时EC₅₀通过拟合剂量-反应曲线并获得50%唾液酸仍保留在细胞表面的浓度来计算。对于所有细胞系，新的抑制剂也被证明比母体化合物P-SiaFNAc更有效。对于几种化合物，即使在反应较差的小鼠癌细胞系如EL-4中也发现了抑制作用。尽管P-SiaFNAc在体外B16F10细胞中显示出低抑制效力 (>50 μM)，但它已被证明可以减少体内肿瘤生长。在五种细胞系中，C-5修饰类型对抑制效力趋势与THP-1细胞的观察结果一致，化合物4、5、10和12是最有效的抑制剂。

接下来，作者研究了修饰对唾液酸侧链的影响 (图式2)。合成了截短的辛酮糖酸和庚糖酮酸抑制剂16、17、20和21，包含7或8碳骨架。此外，制备了C-5氨基甲酸酯衍生物，以便将这些截断的抑制剂与最有效的氨基甲酸酯抑制剂进行比较。实验还探索C-4和甘油侧链的修饰在多大程度上有助于唾液酸转移酶抑制剂的活性。因此，我们制备了衍生物23和25，其在C-4位置具有叠氮化物或炔丙酰氧羰基和双修饰抑制剂24，其具有C-4叠氮基和C-5氨基甲酸酯。

图式2 合成C-4、C-7和C-8修饰的唾液酸抑制剂

使用上述方案，在THP-1细胞上测试了16、17、20、21和23-25的抑制效力 (图3)。甘油尾巴的截短导致抑制的长度依赖性降低。与P-SiaFNAc相比，辛酮糖酸16显示出活性的丧失。有趣的是，用C-5乙酰胺代替氨基甲酸酯会导致抑制效力的恢复。庚糖酮酸20和21都几乎没有表现出任何活性。C-4叠氮基 (23) 的引入导致抑制活性与P-SiaFNAc相近。将叠氮化物换成炔丙酰氨基甲酸酯 (25) 导致活性丧失，表明该位置仅允许进行微小的修饰。值得注意的是，C-5氨基甲酸酯与C-4叠氮化物 (24) 联合使用导致抑制效力显着降低，而早期的研究表明氨基甲酸酯抑制剂更有效。

图3 截短的和C-4取代的氟化类似物对α2-3-唾液酸抑制存在剂量依赖

之后作者研究了代谢唾液酸标记试剂的结构-活性关系

为了研究增加的代谢处理是否也可用于改善唾液酸的代谢标记，制备了三种不含氟的炔基唾液酸衍生物26-28。这些衍生物携带相同的炔基报告基因，其通过C-5酰胺、尿素或氨基甲酸酯基连接，类似于化合物3，5和7 (图4)。将THP-1细胞与4-512 μM 26-28孵育3天。掺入的可视化通过将掺入的炔基与叠氮化生物素偶联，然后与链霉亲和素孵育，与藻红素染料 (PE) 偶联实现。然后用流式细胞仪测量荧光 (如图4)。氨基甲酸酯27显示出最有效的掺入，其次是尿素28和酰胺26。为了最大限度地减少生物素偶联步骤中炔烃反应性差异的影响，使用大量过量的叠氮化物试剂来驱动反应完成。此外，使用高浓度的唾液酸衍生物 (26-28) 导致荧光信号出现类似的平台，如果炔烃反应性的差异发挥作用则不会。同时，化合物26-28的浓度依赖性掺入遵循与抑制剂类似物3、5和7相同的趋势。

图4 含炔基糖掺入细胞表面聚糖

综上所述，本文制备并测试了一组 (3-氟)唾液酸的C-4、C-5、C-7和C-8衍生物。C-5氨基甲酸酯、尿素、硫脲和S-硫代氨基甲酸酯衍生物是比相应的C-5酰胺更有效的抑制剂。C-4的微小修饰是耐受的，甘油侧链的调整导致抑制的长度依赖性降低。非氟化类似物的掺入在C-5位显示出与氟化对应物相似的趋势。这些结果可以用于进一步设计抑制剂和利用相同代谢途径的标记试剂。

文章作者：LYJ

DOI：10.1021/acschembio.1c00868

责任编辑：LD