分享一篇发表在JACS上的文章,题目为“A Lung-Expressing mRNA Delivery Platform with Tunable Activity in Hypoxic Environments”。mRNA传递平台通常在静脉注射后促进肝脏中的蛋白质表达，并已优化用于正常氧合细胞。许多疾病的特征是缺氧，可使mRNA治疗的疗效降低80%以上。在这里，作者报道了一个用于mRNA递送的可调节肺表达纳米颗粒平台(TULEP)，在缺氧环境下能有最佳表达。简而言之，作者的研究从一种新型氨基丙烯酸酯聚合物的合成和表征开始，这种聚合物可以有效地与mRNA有效载荷络合成TULEPs。作者研究了利用TULEP传递mRNA的功效和机制。然后，作者评估了缺氧条件下的TULEP，并通过使用ATP调节来解决缺氧相关的功效缺陷。最后，作者分析了TULEP平台在小鼠体内的mRNA表达、生物分布和耐受性。

为了开发一种肺表达和缺氧可调的mRNA PNP，作者首先设计并合成了一种新型的氨基丙烯酸酯(AA)聚合物，通过在温和的反应条件下将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI)与6-碳炔酸盐尾部反应。这种新型聚合物结合了几种可能有利于mRNA递送的结构设计特性，(1)高胺密度促进与mRNA的有效络合，(2)酯键促进耐受性，(3)疏水尾巴促进自组装，(4)基于聚乙烯亚胺(PEI)的化学促进递送到肺部，(5)可调节性，使其活性可以在常氧和缺氧条件下进行优化。接下来，作者研究了新型AA聚合物将mRNA有效载荷复合到TULEP中的能力。作者首先通过AA聚合物和编码萤火虫荧光素酶（FLuc）报告基因的mRNA混合来制备TULEP;然而，该制剂在PBS中缺乏稳定性，因此被认为不适合长期使用。为了解决这个问题，作者假设在配方中添加PEG衍生物可以提供更好的稳定性，同时还可对 TULEP 的特性进行调节，这可能对mRNA递送很重要，包括其大小、电荷和封装效率。为此，作者制定并表征了一系列具有不同PEG摩尔比、顶部基团、PEG分子量和N/P比的TULEPs。还进行了透射电子显微镜以评估TULEP的表征。在对这些数据进行集体分析时，出现了几个趋势。首先，增加PEG的摩尔比或PEG尾部的长度导致PNP大小的普遍减小，而顶部基团对大小的影响最小。其次，在PEG摩尔比、顶部基团和分子量的变化对电荷的影响不大。第三，所有研究制剂的mRNA封装率均大于80%。第四，用PNP制剂处理的A549细胞的FLuc表达水平和活力受PEG 摩尔比、顶部基团和分子量的影响。基于这些结果，作者选择使用0.25 mol%的PEG百分比、C14 PEG顶部基团和PEG分子量1K、2K、3K和5K进行实验，因为这些设计表征在各自的参数研究中产生了最高的mRNA表达水平（如图1）。

作者试图更好地了解V-ATP酶(一种质子泵，可以促进质子流入内体/溶酶体并影响质子海绵效应)的抑制如何影响TULEPs的内体逃逸。为了评估这一点，作者试图利用流式细胞术来评估表达传递mRNA的处理细胞百分比的减少。为此，作者选择在本实验中传递Cy5标记的编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的mRNA(考虑到EGFP可以使用流式细胞术检测)。作者用可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 EGFP mRNA)包封TULEPs处理A549细胞(其V-ATPase活性被巴菲霉素A1抑制)。然后，作者量化EGFP+ A549细胞减少的百分比，作为内体逃逸减少的测量，导致EGFP mRNA翻译减少(如图3)。作为对照和基准，在使用Cy5 EGFP mRNA包封的Moderna LNP制剂处理的A549细胞中，也量化了这一百分比的降低。在此基础上，作者还试图了解同时抑制V-ATPase和特定细胞摄取途径如何影响TULEPs的活性。为此，作者同时用巴菲霉素A1和一种抑制剂(filipin)处理A549细胞，以抑制小窝蛋白介导的内吞作用;Pitstop 2 -抑制网格蛋白介导的内吞作用;EIPA -抑制巨红细胞增多症;或细胞松弛素D -抑制吞噬作用)。然后用可变PEG分子量的荧光标记(Cy5 EGFP mRNA)封装的TULEPs处理这些被抑制的细胞群，并量化每组EGFP+细胞的减少百分比，以及类似的Cy5 EGFP mRNA封装的Moderna LNP基准对照。在对这些数据进行集体分析时，观察到两个关键发现。首先，巴菲霉素A1的抑制作用普遍降低了EGFP+ A549细胞中TULEPs的百分比，这表明V-ATPase活性可能在A549细胞中TULEPs的活性中起作用。值得注意的是，在使用Moderna LNP基准对照处理的细胞中，这种减少明显更高，这突出表明TULEPs和Moderna mRNA LNPs可能利用不同的内体逃逸机制途径。其次，与PEG分子量无关，TULEP的活性受到细胞松弛素D和巴霉素A1抑制的影响最大，这表明吞噬途径和V-ATPase活性可能对作者的TULEP平台的机制活性都很重要。为了进一步证实这些发现，作者还试图研究一种无标记方法（即TULEP制剂中不存在荧光团的方法）。简而言之，在用具有可变PEG分子量的 FLuc mRNA TULEP或 FLuc mRNA封装的Moderna LNP基准对照处理后，使用共聚焦显微镜对浸渍钙黄绿素（一种膜不可渗透的绿色染料，仍被捕获在完整的内体内体内，但如果内/溶酶体破裂，则分布在整个细胞中）浸渍的A549细胞。同样的成像方法也对单独用巴弗洛霉素A1抑制的钙黄绿素浸渍的A549细胞或用巴弗洛霉素A1 和细胞松弛素D抑制，这些细胞也用TULEPs处理。对这些图像的集体分析表明，钙黄绿素在非抑制的A549细胞中在整个细胞中的扩散最大，进一步强调了吞噬途径和V-ATP酶活性对TULEP活性的可能重要性。