DNA损伤被认为是电离辐射和多种化学试剂的细胞毒性作用的原因。在不同形式的DNA损伤中，单链断裂和修饰的核苷酸被认为比双链断裂和DNA-DNA和DNA-蛋白质交联的危害更小。然而，最初形成的DNA损伤可能导致下游产生更有害的后果^[1]。

约翰霍普金斯大学的Marc M. Greenberg教授团队探索了由DNA损伤引起的后续化学反应。该研究以“Intracellular Formation of a DNA Damage-Induced, Histone Post-Translational Modification Following Bleomycin Treatment”为题，发表于jacs。

如方案1所示，核小体中的组蛋白赖氨酸与通常产生的C4'-氧化无碱基位点(C4-AP)反应，同时在赖氨酸和DNA链断裂上产生亲电修饰。C4-AP由各种DNA损伤剂，包括抗肿瘤剂，例如博来霉素(BLM)引起^[2]。组蛋白在核小体核心颗粒(NCP)的C4-AP处催化DNA切割，此外，负责亲核攻击的赖氨酸的ε-胺转化为5-亚甲基-2-吡咯酮(K_MP)。K_MP构成DNA损伤诱导非酶组蛋白翻译后修饰(PTM)。这种修饰改变了赖氨酸上的电荷，它是调节染色质结构和基因表达的重要PTM。

方案1 由C4-AP形成的K_MP

作者首先研究了用破坏剂处理的细胞中是否能产生K_MP修饰的组蛋白。由于预计单个细胞中约3000万个核小体中只有一小部分组蛋白含有K_MP，因此需要开发一种探针来富集含有PTM的组蛋白。探针1（方案2）由三个结构域组成，包括生物素，可在一端下拉K_MP修饰的分子，另一端为硫醇，与K_MP共价结合。光可切割结构域由光氧化还原基团组成，将这两种成分连接起来，在温和条件下分别释放K_MP修饰的蛋白质或肽用于蛋白质印迹或LC-MS/MS检测。

方案2 细胞内K_MP的检测

选择博来霉素作为破坏剂处理HeLa细胞，用1处理分离的染色质以捕获K_MP修饰的蛋白质，检测到所有四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）（图1A）。修饰组蛋白H2B和H3的含量高于H2A和H4，并且在用低至20 μM BLM 处理HeLa细胞时检测到（图1B）。

图1 K_MP修饰组蛋白的检测

为了确定哪些组蛋白赖氨酸残基被修饰，对用1处理的分离蛋白质的胰蛋白酶消化物进行LC-MS/MS分析，然后通过搜索质谱来鉴定肽，在四种核心组蛋白中，鉴定了17个独特的K_MP位点（图2A）。

图2 通过 LC MS/MS 鉴定 K_MP 修饰的组蛋白

需要在赖氨酸的ε-胺上独立合成含有K_MP的肽，以验证从下拉实验中鉴定的肽。通过独立合成验证了从BLM处理的HeLa细胞中鉴定的三种肽（图2B）。合成分子的片段化模式和从博莱霉素处理的HeLa细胞中鉴定的相应肽存在显著重叠，验证了LC-MS/MS分析的结果（图2C）。

通过考虑BLM损伤的首选位点(5'-GpC/T)及其与组蛋白赖氨酸残基的接近程度，确定的K_MP位点是合理的。将NCP结构内的DNA损伤位点与位置重叠在BLM处理的HeLa细胞的组蛋白中检测到K_MP的位置说明了它们通常非常接近（图3）。

图3 BLM诱导的K_MP位点和DNA损伤的相近性

总结一下，作者开发了一种化学蛋白质组学方法来鉴定HeLa细胞中的K_MP。每个细胞产生超过60000个K_MP修饰的组蛋白。使用LC-MS/MS，在四种核心组蛋白中的57个赖氨酸残基中的17个检测到K_MP。因此，K_MP构成了DNA损伤诱导的非酶组蛋白翻译后修饰，表明DNA损伤导致的下游过程可能对细胞产生影响。

黄硕课题组硕士生