推荐一篇发表在Nature Communication上的文章，文章标题为“Characterize direct protein interactions with enrichable, cleavable and latent bioreactive unnatural amino acids”，第一通讯作者为浙江大学生命科学研究院的杨兵研究员。杨兵研究员致力于以生物质谱、化学生物学以及计算蛋白质组学为基础，开发新的蛋白质组学分析技术，用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰。

研究蛋白质相互作用（PPI）对于揭示靶蛋白的功能以及系统性地理解相关生物过程至关重要。传统的PPI研究方法如亲和质谱，需要裂解细胞，从而分离和鉴定互作蛋白。然而裂解细胞会干扰蛋白的亚细胞分布并稀释蛋白，可能会导致一些结合蛋白分离或者产生一些非天然的蛋白相互作用。而基因编码的具有潜在生物反应性的非天然氨基酸（Uaa）能够原位捕获活细胞中直接相互作用的蛋白质，并且通过鉴定Uaa介导的交联肽段来确定相互作用界面。但是由于蛋白样品的复杂性以及交联肽段较低的离子化效率，鉴定Uaa介导的交联肽段仍旧很有挑战性。即使肽段水平富集显著增加了检测的灵敏度，但是仍存在交联效率较低的问题，导致被鉴定的交联肽数量较少。后来，人们开发出了可富集的具有潜在生物反应性的Uaa EB3，并在活细胞模型蛋白中成功验证，但是这种Uaa只能与蛋白组中丰度较低的半胱氨酸反应，仍然无法很好地满足需求。最终，具有多种氨基酸反应性、交联效率较高并且可富集的氟硫酸盐-L-酪氨酸（FSY）被开发出来，这种Uaa对Lys、His以及Tyr侧链基团都具有反应性，在体外和活细胞中都具有很高的交联效率，但是FSY的脱靶效应和交联产物还没有经过质谱验证。

基于上述背景，作者在FSY的基础上，结合了MS可裂解小分子交联剂以及化学裂解交联Uaa的特点，设计出了一种从未被报道过的MS可裂解化学交联Uaa（MSCXUaa）。MSCXUaa具有以下优点：首先，与小分子交联剂相比，MSCXUaa可以进入活细胞中在生理条件下原位交联，而不用杀死细胞，能够避免对原有蛋白相互作用的干扰。其次，相较于化学裂解的光交联Uaa，MSCXUaa能够在一级质谱中保持交联肽段的完整性，增加交联肽段鉴定的特异性。最后，质谱可裂解的交联肽段相较于不可裂解的交联肽段具有更高的离子化效率，可以在二级质谱中产生更多包含交联位点的碎片离子，进而提高交联肽段的碎片离子覆盖率。

作者首先尝试通过遗传密码子拓展技术在大肠杆菌中表达基因编码的MSCXUaa。作者通过五步合成得到了MSCXUaa并命名为eFSY（如图1a所示），并将氨酰tRNA合成酶chPheRS-1的氨基酸结合口袋进行了改造以匹配eFSY的结合。作者将190位含有TAG密码子的带有His标签的EGFP与chPheRS-1的不同突变体共表达，然后通过His标签纯化结合凝胶电泳以及高分辨电喷雾电离飞行时间质谱分析筛选出了能够识别eFSY的突变体（V393G，F464C），并命名为eFSYRS。为了验证eFSY的成功插入，作者将24位为TAG密码子的带有MBP与His标签的Z蛋白与eFSYRS在DH10B中共表达，并通过完整蛋白质谱以及Glu-C酶切肽段串级质谱分析证实eFSY成功插入到了MBP-Z的24号位点（如图1b-f所示）。

已知FSY能够与His、Tyr以及Lys侧链基团交联，为了测试eFSY的交联能力，作者将MBP-Z（E24eFSY）与不同亲和突变体（7Ala，7Lys，7His，7Tyr）共孵育。WB和串级质谱证明了eFSY能够与His、Tyr和Lys产生交联。通过在eFSY位点引入生物素标签并用单亲和微球进行富集，交联肽段的富集度增加了十倍，验证了eFSY可富集的特点（如图1g-l所示）。

图1. eFSY在大肠杆菌中的表达与鉴定示意图

接着，作者尝试用eFSY来确定Trx1在大肠杆菌中的直接作用蛋白。作者在大肠杆菌中将eFSY引入Trx1的62号位点（如图2a所示），并使用BprY、FSK作为对照。WB结果显示出众多可以被生物素标记的交联条带，表明eFSY可以成功捕获到Trx1的相互作用蛋白（如图2b-c所示）。经过His标签纯化、生物素标记以及链霉亲和素富集之后，在三次重复实验中共鉴定到150个蛋白上的311个交联位点（如图2d-e所示）。上述结果表明eFSY具有较高的蛋白交联效率。

作者在分析质谱数据时发现eFSY与His、Lys产生的交联是质谱可裂解的，与Tyr产生的交联是质谱不可裂解的，而在可裂解的交联中还包括交联键断裂与交联基团内部碎裂两种碎裂模式（如图2f-i，3a-b所示）。由于目前没有能够完美分析这种交联质谱数据的软件，作者开发出了一个能够考虑到文中所有形式的碎片离子的搜索引擎AixUaa。AixUaa运行的基本逻辑如图3c所示。为了评估AixUaa鉴定Uaa介导的MS可裂解的交联质谱数据的能力，作者构建了四个模拟的U-H/K交联数据库Sim1-4，并将AixUaa与现有搜索引擎进行对比，结果表明相较于现有的数据库搜索引擎，AixUaa展示出了更高的鉴定精度。作者又将AixUaa用于分析硫氧化还原蛋白富集样品，如图3d-e所示，AixUaa鉴定出了更多的U-H/K交联位点，总的交联肽段鉴定数为391，对应184个蛋白。从图3f中可以看出，鉴定到的交联位点主要为Lys，这可能与Lys在细胞中的较高丰度有关。

图2. 在大肠杆菌中用eFSY插入的Trx1捕获鉴定Trx1的直接相互作用蛋白组

图3. eFSY交联肽段的碎裂模式与AixUaa程序的开发

作者接着测试了哺乳动物细胞中eFSY的插入和交联能力，在HEK293T细胞中共转染EGFP-151TAG以及pNEU-eFSYRS质粒，并将细胞置于含有eFSY的培养基中培养。荧光显微镜观察得到的荧光信号以及完整蛋白质谱和串级质谱数据证明了EGFP-190eFSY的成功表达（如图4a-c所示）。为了确定eFSY在哺乳动物细胞中的交联能力，作者在HEK293T细胞的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的二聚体界面103位点引入了eFSY。WB成功检测到了eFSY介导的二聚体交联带(如图4d所示)。进一步的串联质谱分析鉴定出三个链间交联肽，交联位点与eFSY结合位点非常接近(如图4e所示)，并且这些交联位点能够通过高质量串联质谱精确定位(如图4f-h所示)。这些结果表明，eFSY可以有效地掺入到哺乳动物细胞中，并且在活细胞中具有较高的交联效率。

图4. eFSY在哺乳动物细胞中表达并用于交联鉴定相互作用蛋白组

微量元素硒在细胞中以硒代半胱氨酸的形式存在于硒蛋白的活性位点，然而由于硒代半胱氨酸是由终止密码子TGA编码的，难以获得大量天然的硒蛋白，硒蛋白的功能还没有得到深入的研究。因此，作者将eFSY用于检测硒蛋白的直接相互作用蛋白组，进而更好地了解硒蛋白的功能。作者将eFSY插入到活细胞中硒蛋白SELM的48号硒代半胱氨酸位点上（如图5a所示），首先进行了WB分析，结果显示SELM与内源蛋白发生了交联，并且这些交联蛋白复合体能够被生物素标记（如图5b-c所示）。接着作者将交联蛋白用Strep IP纯化后，用生物素标记，接着用胰酶水解，再用单亲和凝珠富集交联肽段，最后进行质谱分析。在三次重复试验中共鉴定到24个交联肽段，对应10个与SELM直接相互作用的蛋白（如图5d所示）。SELM定位位于核周结构中，对应于内质网和高尔基体，而鉴定得到的相互作用蛋白同样主要分布于内质网和高尔基体，这证明了eFSY交联具有一定的空间特异性。作者在这些蛋白中随机选择了四个蛋白进行Co-IP实验，WB分析结果证实了这些蛋白确实与SELM存在相互作用（如图5e所示）。接着，作者选择交联位点附近含有半胱氨酸的PRDX4蛋白，使用二硫键捕获法再次证实了SELM与PRDX4之间存在相互作用（如图5f-h所示）。

图5. 通过eFSY介导的原位交联鉴定SELM的直接相互作用蛋白组

综上所述，本文中作者设计并合成了一种具有潜在生物反应性、可富集性并且MS可裂解的Uaa - eFSY，同时通过定向进化获得了一种能高效识别eFSY的氨基酰基- tRNA合成酶eFSYRS。利用eFSYRS，作者在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功插入了eFSY，而插入的eFSY成功地捕获了瞬时和直接的蛋白质相互作用位点。eFSY上带有的click抓手还可以进行多肽水平富集，进而实现大肠杆菌和哺乳动物细胞中PPIs的高通量鉴定。基于eFSY交联肽段的质谱裂解模式，作者还开发了搜索引擎AixUaa，以提高质谱鉴定的灵敏度和序列覆盖率。