在斑马鱼中通过GFP定向的邻近依赖型生物素标记的体内蛋白质组学研究

郝凡锐 2021.10

原文：In vivo proteomicmapping through GFP-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.7554/eLife.64631

1. 1.  文章来源介绍

昆士兰大学分子生物科学研究所Thomas E Hall等人于2021年10月在elife上发表了题为“In vivo proteomic mapping throughGFP-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish”的文章。揭示了一种在斑马鱼中进行GFP定向邻近生物素标记的新方法——BLIZT,能够以细胞和组织特异性的方式在体内识别蛋白质互作且具有广谱性。为检测其他生物体内的蛋白质互作、生物素化的检测提供了新的思路。

1. 2.  研究背景及科学问题

蛋白质互作作为一种复杂的细胞内过程具有极其重要的意义，是细胞生命活动的基础。然而对于蛋白质互作之间的强弱、时间长短仍然不清楚。目前已有很多研究报道生物素连接酶可以标记蛋白质的生物素化，与传统的用蛋白质特异性抗体或亲和纯化标签进行亲和纯化相比，BioID方法具有能够捕捉微弱和瞬时相互作用的优势。然而，若想直接用生物素连接酶对每个感兴趣蛋白质进行基因标记并产生转基因生物，BioID的适用性便受到了限制。因此作者描述了一种更通用的方法来在脊椎动物模式生物斑马鱼体内应用BioID。作者将BioID与能和GFP结合的GBP融合，从而靶向GFP标记的特异蛋白，开发了一种GFP定向蛋白质组的新系统——BLITZ。

1. 3.  重要发现

2. 1).TurboID具有明显的邻近生物素化标记能力

首先作者构建了分别带有Myc标签和eGFP的表达载体显微注射到斑马鱼胚胎中，获得转基因斑马鱼胚胎。为检测它们确实可以促进蛋白质生物素化，取斑马鱼胚胎总蛋白裂解液进行SDS-PAGE和链霉亲和素免疫印迹分析。结果发现相较于其他两种生物素连接酶，TurboID在生物素浓度为500uM下能明显的检测到外源生物素化条带（图B）。

为探究生物素浓度与孵育时间对生物素化的影响，将表达TurboID的胚胎在含有生物素浓度为0~750 mM的胚胎培养基中孵育18小时，并设置时间梯度观察生物素化的变化。最终确定在生物素浓度500、750uM，孵育时间18h下生物素化最明显。

2).TurboID邻近生物素化具有较高的空间分辨率

为测试TurboID在斑马鱼中催化生物素化的空间分辨率，作者分别用核定位信号（NLS）、质膜定位信号(CAAX)、跨膜蛋白（CD44b）和肌肉T管富集膜蛋白（Cavin4b）标记TurboID，观察生物素化的标记位置。发现在标记特定的信号或蛋白相对应的位置均检测到生物素化。此外链霉亲和素检测到特异标记的蛋白都有独特的蛋白质条形码，表明每个相应的亚细胞都有特异的蛋白质。

3).dGBP(GFP结合蛋白)靶向结合斑马鱼中GFP标记蛋白

为检测邻近蛋白的生物素化，若采用之前的方法——斑马鱼胚胎显微注射TurboID—GFP载体，亦或为研究其他感兴趣蛋白或亚细胞结构，需要为TurboID—GFP载体特异标记亚细胞定位信号等，这样的工作量巨大且单细胞阶段注射3d内蛋白质耗尽，若要观察生物素化只能选择早期胚胎。为解决这一问题，通过之前文章报道，作者找到一种GFP结合蛋白——GBP（能够在细胞培养和斑马鱼系统中靶向GFP标记的POI的过氧化物酶）。作者推测，将GBP与TurboID融合可以靶向GFP标记的特异蛋白，实现GFP引导的生物素化。

为验证这一假设，将红色荧光蛋白(MRuby2)与GBP融合，并在已经表达Cavin1a-Clover的转基因斑马鱼中瞬时表达。发现MRuby2-GBP低水平表达时有明显的膜共定位，但当表达水平升高时，胞质中也出现了共定位。因此推测GBP与GFP可能存在非特异结合。因此后续作者选择了dGBP替代GBP。其优势是在未结合GFP时 该物质则会被降解，具有较高的GFP结合特异性。

4).BLITZ技术

以上已经找到GFP引导的生物素化的途径。因此接下来作者想知道这种检测生物素化的方法是否可以区分不同蛋白质或特异性标记的亚细胞结构。首先作者给TurboID-dGBP加上红色荧光蛋白mKate2作为报告子，接下来用eGFP标记了血管和神经元两种组织结构，将actb2: mKate2-P2A-Myc-TurboID-dGBP转基因斑马鱼与GFP标记蛋白质的转基因斑马鱼杂交，并于生物素进行孵育后发现，确实可以在两种结构中检测到生物素化。这些结果表明我们的TurboID-dGBP系统可以产生具有组织特异性的生物素化。

接下来用同样方法验证与空泡小窝蛋白形成相关的蛋白Cavin1a和Cavin4a，也可以观察到明显的生物素化。说明这种技术在蛋白质与亚细胞结构中均有作用。

5).验证BLITZ系统的实用性

为验证这个新型标记技术的可靠性，作者将TurboID-dGBP与Cavin-Clover两种转基因斑马鱼杂交，并对具有共定位的斑马鱼蛋白进行质谱分析，发现了大多数蛋白均与Cavin蛋白相关并且经过检测发现这些蛋白都是与质膜蛋白相关，而Cavin蛋白也定位于质膜，因此说明了这种BLIZT系统的精确性。

1. 4.  总结

本文的新颖之处在于发明了一种新的检测生物素化的技术——BLITZ, 其优势在于：1）不需要复杂的分子操作，通过两种转基因斑马鱼的杂交即可验证蛋白或组织的生物素化；2）这种技术使细胞与组织特异性蛋白研究成为可能，因为TurboID-dGBP此技术的稳定性依赖于与GFP靶标的结合，可以避免非特异性的生物素标记。

然而BLITZ虽能够以细胞和组织特异性的方式高精度地在体内识别蛋白质相互作用因子，但内源性生物素干扰较强，如何排除内源性生物素干扰还需进一步解决。