Self-Replicating DNA-Based Nanoassemblies.DNA 纳米结构和纳米组装体在诊断、药物输送、细胞成像、生物传感等许多领域显示出前景。控制和调节 DNA 纳米组件结构的能力促进了具有复杂响应能力的仿生系统的发展。然而，有关 DNA 纳米组件复制都需要多种干预措施才能实现。DNA 纳米组装复制的另一种方法涉及使用滚环扩增 (RCA) 来扩增寡核苷酸，然后将寡核苷酸组装成纳米结构。在一个例子中，Sleiman 和同事利用 RCA 制备了一条长主链 DNA 链，在单独的后续程序中将其组装成 DNA 线框纳米管。通过 RCA 进行基于纳米结的互补纳米结构的交叉催化复制，复杂的多重交叉纳米结构和圆圈也已被报道，但所有这些过程都需要单独的步骤和额外的加工酶来生成互补纳米结构的副本，然后才能组装。最近报道了一种用于环扩增的一锅多酶程序，但它本质上仅限于环结构。理想的自我复制过程将自主发生，无需外部调节成分或环境条件。实际上所有方法都基于聚合酶反应，例如 RCA，需要后续处理、分离和组装步骤，以允许复杂结构的交叉催化复制。相反，损伤-诱导 DNA 扩增 (LIDA) 是一种交叉催化连接酶链式反应，它使用不稳定的脱碱基基团来实现 18 聚体 DNA 双链体复制中的自主更新。研究人员假设 LIDA 适合自我复制三角形纳米结构，这是一种 DNA 线框组装中的常见基序，只需通过 LIDA 进行一次成键反应即可产生。研究人员使用基于 LIDA 的交叉催化方法演示了两种类型的三角形线框组件和环状 DNA 的自主自我复制。
方案1
三角形的自我复制将从三角形与两个片段的杂交开始，其中一个片段包含不稳定的无碱基基团（方案1，粉红色链，顶部循环）。通过 T4 DNA 连接酶连接后，由于不稳定损伤，所得双链体应自发解离。所得的不稳定模板可以与纳米组装体的开放形式杂交，并通过连接形成其闭合模板（方案 1，底部循环）。这个过程应该继续导致三角形和不稳定模板的 S 形放大，直到所有组件都被消耗。研究人员制备了一段 72 核苷酸长度的 DNA (Linear72)，它有两个与溶液中的寡核苷酸互补的区域，杂交后形成三角形的两侧和两个 9mer 序列，一个位于 5'端，另一个位于3'端，与LIDA 片段互补（方案 1）。这些互补区域中的每一个都被六个核苷酸分开，以提供可以容纳闭合三角形形式的灵活角。Linear72 被荧光标记，以便通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 对三角形形成进行简单分析。图1
第一个需要解决的问题是Linear72 的模板化连接是否会导致环化（闭环形成三角形）或聚合（图 1A）。在 T4 DNA 连接酶存在的情况下，10 分钟内 80% 的 Linear72 在 16 °C 下连接，优先形成一种产物（图 1B）。为了确定连接产物的性质，随后添加了核酸外切酶 VII (Exo VII)，因为它选择性消化线性 DNA 链。如泳道 3 所示，用酶处理后，仅保留了主要产物条带，表明它是 Linear72 的闭环形式。值得注意的是，LIDA 中显示该浓度可导致快速自我复制20,25,26 表明该浓度应促进纳米组件的自我复制（方案 1）。
图2
为了确定是否可以通过 LIDA 自我复制 DNA 线框三角形，研究人员将 1% (14 nM) 的 Triangle72 与过量的 Linear72 以及互补的两个片段结合起来，在这些条件下，在 26 °C 下用 1% Triangle72 启动 LIDA 会导致 Triangle72 呈 S 形生长，并在一小时内扩增超过 80 倍Triangle72 的 S 形放大曲线表明研究人员的策略确实能够自我复制三角形线框结构（图 2A，实线）。此外，Triangle72 的自我复制速度比 LIDA 的类似 18mer DNA 双链体更快，这可能归因于分子内环化的有效浓度更高。在 22 °C 下，反应动力学非常缓慢，240 分钟后 Linear72 转化为 Triangle72 的转化率为 40%。当反应温度升至 30 °C 时，动力学显著增加，反应在 40 分钟内达到 >80% 转化率的稳定水平。研究人员还进行了缺少 Triangle72 初始 1% 的对照实验（图 2A，虚线）。在这里，研究人员观察到当不存在初始 Triangle72 且起始延迟时，Triangle72 的 S 形形成。研究人员推断构成去稳定模板的片段可以通过基于与 Linear72 杂交时脱碱基和磷酸腺苷之间的单碱基突出的假平端连接来连接（图 2A）。这导致少量不稳定模板和Triangle72的缓慢形成，这足以启动快速交叉催化扩增过程。接下来，通过用互补的胸腺嘧啶而不是脱碱基位点替换脱碱基磷酸盐来测试 LIDA 技术中不稳定脱碱基位点的作用。如图 2B 所示，未实现 S 形扩增，因为 DNA 链的完全互补性使产物双链体高度稳定，降低了自发解离的机会（方案 1）。相反，有和没有 1% Triangle72 的连接反应的动力学非常相似，与由于单个 A:T 碱基突出而不是通过自我复制形成的三角形连接一致（图 2B）。图 2B 中相对较慢的连接动力学可能是由于温度升高 (26 °C)，减轻了单碱基突出复合物的形成。
图3
为了将此方法扩展到包含非自然角单元的混合纳米组件，研究人员用辛二醇有机连接体替换了 Triangle72 的 6-nt 角。当研究人员在使用和不使用 1% Triangle54org 的情况下进行相同类型的 LIDA 实验时，观察到混合纳米组件 Triangle54org 的轻松自我复制。与 Triangle72（图 3）相比，LIDA 对 Triangle54org 的自我复制速度明显更快，并且与 Triangle72相比，表现出更高的形成多种聚合产物的倾向，导致总产率较低。更快的复制和更大的聚合程度表明疏水性有机连接基使 LIDA 本质上更快，而不仅仅是促进三角形的闭环。最后，研究人员探索了第三个系统的动力学，该系统由与 Linear72 中使用的相同 72mer 组成，但没有使三角形两侧刚性化的互补链（方案 1，紫色链）。在研究人员的标准条件下，Circle72 系统还表现出优先闭环和 S 形自我复制（图 3）。此外，它具有中等的自我复制速度，比 Triangle72 快，比 Triangle54org 慢。连接酶与其他 DNA 双链体区域的结合应会减慢高效酶-底物复合物的形成，这与 Triangle72 与 Circle72 相比较慢的催化作用一致。最重要的是，这三种结构的成功自我复制表明 LIDA 可用于自我复制环状单链 DNA 以及有机混合线框纳米组件。研究人员当前和之前的工作已经展示了通过改变温度、不稳定片段中的不稳定量以及连接混合物中 ATP 和 Mg2+ 浓度来优化 LIDA 自我复制速率和程度的不同方法。25,27 因此， 可以使用类似的方法调整不同类型纳米组件的自我复制率。LIDA 的这种纳米组装自我复制应该适用于较大 3D 纳米结构的自我复制，例如由三角形线框片段制成的三角棱柱或 DNA 纳米管。可以使用相应的去稳定模板，通过构成棱柱顶部和底部的两个闭环反应，从二维片材合成三角形纳米棱柱。通过将纳米组装体的形成分为一个循环，并将简单的 18mer 链的形成分为另一个循环，可以避免互补纳米结构解离中的任何复杂情况。纳米组装自我复制是仿生自组装领域的一项重要成就，许多纳米组件根据其 3D 形状实现其功能，例如基于 DNA 的膜通道。将自我复制纳入此类 3D 组件中可能会产生高度灵敏的智能系统，能够将货物输送到由特定触发的细胞中。
DOI: 10.1021/jacs.4c04089
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.4c04089
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