Nat. Commun. | 高压氧增强肿瘤渗透和工程细菌的积累,用于协同光热免疫治疗

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分享一篇发表在Nature Communication上的文章,题目为“Hyperbaric oxygen enhances tumor penetration and accumulation of engineered bacteria for synergistic photothermal immunotherapy”。在本文中,作者采用cypate分子修饰大肠菌杆Nissle1917(EcN),产生用于光热疗法的EcN-cypate,随后可诱导免疫原性细胞死亡(ICD);同时采用高压氧(HBO)非侵入性疗法以高效消耗致密的细胞外间质,从而增加肿瘤内细菌的积累,从而实现理想的肿瘤根除。

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细菌介导治疗是一种有前途且强大的癌症治疗模式,具有肿瘤靶向增殖和激活抗肿瘤免疫应答等能力,可以与其它抗肿瘤技术联用以增强癌症治疗效果。然而,细菌大小、致密穿透深度(ECM)和高肿瘤间质压力,肿瘤内递送效率不足和工程细菌的低细胞外间质仍然是不可避免的挑战,限制了癌症治疗的有效性,为此亟需开发简便、通用的策略以实现有效的瘤内递送和细菌的深度瘤内渗透方法。高压氧(HBO)治疗是克服肿瘤缺氧,消耗ECM和促进药物在实体瘤中渗透的最有效方法之一,已被广泛用作改善化疗,光动力疗法,放疗,PTT和免疫疗法的治疗性能的辅助方法。在本文中,作者使用兼性厌氧益生大肠杆菌 Nissle 1917(EcN)作为模型细菌来研究高压氧对肿瘤治疗过程中细菌活性的影响。

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图1

高压氧可以增加血液和组织中的氧气压力,这可能引导兼性厌氧菌(EcN)在高压氧治疗过程中对低氧肿瘤表现出改善的靶向能力;另一方面,HBO也可以消耗致密的ECM,以增强肿瘤内渗透和ECN的积累。如图1a所示,通过酰胺化反应,用光热荧光团(cypate)修饰EcN的表面,得到EcN-cypate。高压氧治疗后促进了EcN-cypate在肿瘤组织中的积累。在近红外(NIR)激光照射下,EcNcypate实现PTT并触发免疫原性细胞死亡(ICD),其引发全身性免疫应答,如树突状细胞(DC)成熟以根除肿瘤(图1b)。

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图2

首先,本文探究了HBO是否能够消耗致密的ECM以促进细菌(EcN)在实体瘤内的积累和渗透,这对于实现有效的基于细菌的癌症治疗是必不可少的(图2a)。作者从“ HBO +”组(其中荷瘤小鼠以1.5大气绝对值(ATA)用 HBO 处理2小时)和对照组(没有 HBO 处理,“ HBO-”)中的小鼠收集肿瘤进行转录组分析。具体而言,火山图和热图结果显示共检测到184个(95个上调和89个下调)差异表达基因(DEGs)(图2b,c),表明 HBO 治疗后肿瘤的显着变化。此外,还对肿瘤组织进行了GO(Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)富集分析。如 GO 富集分析结果(图2d)所示,与 ECM 相关的 DEGs (例如细胞外区域,细胞外液,细胞外间质,外包封结构和含胶原蛋白的细胞外间质)和一些生物过程(BP)相关的 DEGs (例如细胞粘附,生物粘附和细胞-细胞粘附)在 HBO 处理后显着受到影响。此外,KEGG 富集分析结果表明,DEG 在 ECM 相关途径(例如 ECM 受体相互作用)和细胞粘附相关信号传导途径(例如粘着斑)中富集(图2e)。此外,ECM的两个主要组分(纤连蛋白和胶原)被染色,并且在 HBO 处理后观察到纤连蛋白和胶原的显着降低(图2f,g) ,进一步证明了 ECM 的消耗。

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图3

接下来,作者探究了HBO对兼性厌氧菌(EcN)瘤内递送的影响。为了监测EcN的分布,本文选择发射红色荧光的表达mCherry的EcN(称为EcN-mCherry)作为模型细菌。为了进行体外研究,本文进一步构建了直径约500 μm的三维培养的多细胞球体(MCS)。如图3a所示,将EcN-mCherry细胞与MCS孵育12小时,并获得共聚焦图像以记录MCS的初始状态(0小时)。之后,“ HBO +”组的MCS接受 HBO 处理(1.5 ATA,2h) ,随后用共聚焦显微镜观察。最初,EcN-mCherry 在“ HBO-”和“ HBO +”组中主要位于 MCS 的外部区域。然而,在 HBO 处理后,在“ HBO +”组中观察到促进的 EcN-mCherry 的渗透/积累 (图3b)。由于其缺氧靶向性,ECN 细胞倾向于向缺氧区迁移。在高压氧处理过程中,MCS 外部环境中的氧浓度增加,在 MCS 内部形成相对缺氧的状态。因此,EcN 更倾向于穿透 MCS 的缺氧内部区域,从而在 HBO 处理后实现增强的积累。为了验证这一猜想,作者静脉内(i.v.)将EcN-mCherry 注射到4T1(小鼠乳腺癌细胞系)荷瘤小鼠中,在注射后12小时用 HBO (1.5 ATA,2小时)进一步处理。有趣的是,在 HBO 处理组中观察到 EcN-mCherry 在肿瘤组织中的显着增加和更广泛的分布(图3c),表明HBO处理促进了TME内细菌的积累和渗透。此外,与对照组相比,来自“ HBO +”组的“63×”放大图像显示肿瘤细胞的不太紧密的分布,这一结果表明,高压氧可能耗尽细胞外基质和影响细胞粘附,与 GO 富集分析结果一致(图2d)。为了进一步阐明 HBO 对 EcN 向肿瘤浸润的影响,作者在注射1×107集落形成单位(CFU) EcN 后的三个时间点(12,36和60h)用 HBO (1.5 ATA,2h)处理小鼠3次,并通过集落计数量化肿瘤中的细菌数量。如图3d所示,HBO处理组24/48/72小时的 EcN 集落计数显着高于对照组,这与统计学结果一致(图3e)。值得注意的是,“ HBO +”组的 EcN 水平在48小时几乎达到平台(图3e),表明只有两次 HBO 处理足以实现肿瘤内显着增加的细菌积累。

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图4

本文进一步探究了cypate修饰的最适浓度,根据扫描电子显微镜(SEM)的结果(图4a),ECN的形态与ECN-cypate的形态相似,表明cypate修饰对细菌的干扰可以忽略不计。随后进行了一系列的实验,证明了cypate在ECN表面的共轭是成功的。如图4b所示,胞果酸的红色荧光显示在细菌表面。此外,EcN-cypate的负zeta电位的绝对值相对于EcN(EcNcypate为-48.5 ± 4.7 mV,EcN 为 -21.7 ± 3.4 mV,图4c)增加,因为每个共轭的cypate分子含有两个羧基。此外,EcN-cypate (1185 ± 188nm)相对于 EcN (953 ± 142nm)(图4d)呈现增加的流体动力学直径,以及与游离cypate(图4e)相似的吸收峰,证明cypate成功的缀合到细菌上。之后,作者证明了cypate修饰对EcN是安全的,因为EcN和ECN-cypate的生长曲线非常相似(图4f)。总的来说,修饰的EcN-cypate保留了其原有的形态和生存能力。

为了测试cypate对PTT的潜在作用,本文使用热成像相机测量了含ECN-cypate的悬浮液的实时温度变化。如图4g所示,当用NIR激光(808nm,1W/cm2)连续照射含有 EcN-cypate的悬浮液7分钟时,记录到明显的温度变化,导致EcN-cypate的形态改变。此外,EcN-cypate 表现出多重加热电位,这可能使进一步重复PTT(图4h)。根据MTT测定结果,EcN-cypate 在没有激光照射的情况下呈现良好的细胞相容性,并且在5 μg/mL浓度下在激光照射下具有显着的细胞毒性(图4i)。为了清楚地显示 EcN-cypate 的 PTT 效应,将不同处理后的4T1细胞与钙黄绿素乙氧基甲酯(calcein-AM)和碘化丙啶(PI)共染色,并且来自死亡细胞的红色荧光信号表明 EcN-cypate 的有效的基于 PTT 的细胞杀伤能力(图4j)。

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图5

本文推测,EcN-cypate介导的 PTT 可以杀死癌细胞以释放 DAMP,这反过来又促进DC的成熟(图5a)。为了验证这个假设,本文在不同的实验组中检测了三种主要DAMP的释放,即三磷酸腺苷(ATP)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和钙网蛋白(CRT)。如图5b,c所示,与其他组相比,用EcN-cypate孵育的细胞随后激光照射(“激光 +”组)表现出细胞外ATP和HMGB1浓度的显着增加。此外,还测量了CRT暴露水平,“激光 +”组呈现最高水平的CRT(图5d),在质膜表面检测到明显的CRT信号(图5e)。共聚焦成像结果显示,与“激光-”组相比,“激光 +”组在细胞核内显示更少的荧光信号(图5f)。流式结果显示,“激光 +”组成熟BMDC的比例(74.0%)显着高于对照组(28.4%)和“激光-”(29.5%)组(图5g)。此外,相应的定量分析进一步证实“激光 +”组成熟 BMDC 的百分比最高(图5h)。

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图6

为了研究HBO是否对工程菌(EcN-cypate)具有与天然细菌(EcN)相当的影响,本文检测了4T1荷瘤小鼠模型中EcN-cypate的体内分布。如图6a所示,EcN-cypate处理组比游离cypate处理组提供更有效的cypate瘤内递送,这可能归因于EcN的缺氧靶向能力。此外,HBO治疗显着改善了EcN-cypate的肿瘤内递送,在注射后48小时观察到最大荧光强度(图6a)。主要器官的离体图像显示胱氨酸主要被肝脏清除(图6a)。另一方面,半定量分析cypate分布进一步验证了HBO在促进基于细菌的药物系统的传递中的关键作用(图6b)。HBO治疗后,缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)的表达下降(图6c),表明HBO克服了肿瘤缺氧。接下来,本文评估了ECN-cypate的体内PTT效应。如图6d所示,在近红外激光照射后15分钟内,EcN-cypate和“ EcN- 半胱氨酸 + HBO”组均显示出显着的肿瘤温度升高。具体而言,“ EcN-cypate + HBO”组的温度在照射期间可以增加到48°C(图6e),这足以实现有效的PTT。

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图7

进一步,本文研究了这种HBO联合PTT治疗的体内抗肿瘤的性能。如图7a所示,作者依次将HBO(1.5 ATA,2h)和激光照射(808nm,1W/cm2,15分钟)应用于EcN注射的小鼠,并在第二天重复上述过程以增强治疗效果。如图7b-g所示,“EcN- cypate + HBO + 激光”组在所有组中表现出最佳的治疗结果,验证了HBO和EcN-cypate介导的PTT组合的高抗肿瘤效力。此外,“EcN-cypate + HBO”组显示出比EcN-cypate组更强的抗肿瘤作用(图7b,d,e)。为了观察不同治疗对肿瘤区域的损伤,本文分别用苏木精和伊红(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶(tdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定试剂盒对肿瘤切片进行染色。根据定量TUNEL测定试剂盒染色结果,“EcN- 胱氨酸 + HBO + 激光”组显示最多的TUNEL荧光信号(图7h),图7i表明该组中最凋亡的细胞。然后作者评估了cypate的体内生物安全性,所有组之间的体重曲线表现出可忽略的波动(图7j)。

最后本文还探究了HBO偶联和EcN-cypate介导的PTT(HBO 偶联 PTT)重编程TME,HBO增强的光热免疫治疗结合PD1阻断治疗来预防肺转移。


本文作者:MKQ

责任编辑:TZM

DOI: 10.1038/s41467-024-49156-6

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-024-49156-6


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