长余辉成像利用长余辉探针在光照停止后缓慢释放出的光子对生物标志物进行分析，可以有效避免外加激发光实时激发所产生的生物组织背景信号干扰。因此，相比于荧光成像，长余辉成像往往可以获得更高的信背比、成像深度及检测灵敏度。然而，在生物体系中，探针的长余辉信号强度易受到其浓度差异与余辉信号衰减等因素的影响，导致仅依赖于单通道长余辉信号强度的成像分析方法会降低目标物检测的可靠性，产生假阳/阴性的诊断结果。

为了克服这一不足，近日，南京大学化学化工学院叶德举教授与南京大学环境学院毛亮教授、南京大学医学院附属鼓楼医院冯敏主任合作，提出了基于“能量分流”的比率型长余辉探针构建策略。该策略利用长余辉发光底物AG-8，在长余辉引发剂ZnPht作用后转化为激发态AG-8*，接着发生“能量分流”过程，具体包含了（1）AG-8*与ZnPht之间的部分“长余辉共振能量转移”（afterglow resonance energy transfer, ARET），（2）ZnPht与近红外荧光染料Cy5.5以及（3）Cy5.5与猝灭剂QSY21之间级联的三步能量转移过程。这一“能量分流”过程可以得到520 nm处长余辉信号“常亮”输出通道（AGL₅₂₀）和710 nm处长余辉信号被酶“激活”的输出通道（AGL₇₁₀），从而产生双通道长余辉信号，实现酶活性激活的比率长余辉（AGL₇₁₀/AGL₅₂₀）成像分析。

作者以金属基质蛋白酶-2（metalloproteinase-2， MMP-2）为例，构建了可靶向αvβ3整合素、MMP-2激活的比率型长余辉成像探针RAG-RGD，应用于活体脑胶质瘤的成像分析。为了探究探针的比率检测性能，作者首先构建无靶向单元的探针RAG，并通过体外溶液实验验证，RAG在MMP-2切割多肽底物前后，AGL₅₂₀一直处于“常亮”状态；而近红外通道的长余辉信号（AGL₇₁₀）只有在MMP-2切割多肽底物后才被“开启”（~13 倍），由此使比率信号AGL₇₁₀/AGL₅₂₀发生了“从低到高”的转变（~11倍）。作者接着构建了可靶向人脑胶质瘤细胞U87MG的比率长余辉探针RAG-RGD。细胞实验结果显示，U87MG细胞经靶向探针RAG-RGD、 cRGD + RAG-RGD及非靶向探针RAG分别孵育后，虽然在细胞中产生不同强度的AGL₅₂₀与AGL₇₁₀长余辉信号，但AGL₇₁₀/AGL₅₂₀的比率信号基本保持一致，而只有细胞经过MMP-2抑制剂SB-3CT处理后，AGL₇₁₀/AGL₅₂₀才明显下降。这一结果表明通过AGL₇₁₀/AGL₅₂₀比率成像，可有效排除细胞对探针摄取差异造成的单通道长余辉信号差异，从而对细胞水平的MMP-2活性进行准确评估。

得益于长余辉探针RAG-RGD具有的优异的成像信背比与成像深度（~ 0.8 cm），作者接着在活体层面考察了RAG-RGD对MMP-2检测的性能。在皮下U87-MG肿瘤模型中，探针RAG-RGD仍然可以发挥比率的自校准功能，排除因肿瘤对探针摄取差异而产生的干扰，对活体肿瘤的MMP-2活性进行精准区分。作者进一步考察了RAG-RGD在原位脑胶质瘤模型中的成像性能。结果显示，RAG-RGD通过尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内后，其在肿瘤的摄取随着原位肿瘤尺寸的增大（肿瘤尺寸以生物发光信号（bioluminescence, BL）为指示）而增加，导致AGL₅₂₀与AGL₇₁₀的各自长余辉信号随之增强。然而，比率信号AGL₇₁₀/AGL₅₂₀却随着肿瘤尺寸的增加而减弱，并保持良好的负相关性。这一实验结果证实了比率长余辉探针RAG-RGD在活体成像中具有的良好自校准优势，即排除肿瘤大小对探针蓄积量的影响与假阳性信号。比率成像结果验证了MMP-2的活性在肿瘤发生发展过程中，随肿瘤尺寸的增加而减小。这种比率信号与肿瘤大小之间的负相关性，预示着长余辉比率成像可以更好地对微小肿瘤灶进行示踪。

总之，在这项工作中，研究团队创新性地提出了“能量分流”的策略，应用于构建MMP-2激活的比率型长余辉探针RAG-RGD。借助长余辉成像具有的高信背比、高成像深度与高灵敏度的优势以及比率分析具有的自校准功能，RAG-RGD可以在皮下肿瘤和原位脑胶质瘤模型中对MMP-2的活性进行成像，有效排除了假阳性信号的干扰，提升了体内MMP-2活性分析的可靠性。借助以上优势， RAG-RGD通过长余辉比率成像证实了MMP-2的活性与脑胶质瘤尺寸之间的负相关性，这有利于对早期的小尺寸肿瘤灶进行检测。由于探针的响应底物可灵活变换，因此，该工作提出的“能量分流”策略将可作为比率型长余辉成像探针构建的通用性平台，应用于不同生物分子的长余辉比率成像分析。