分享一篇发表在Nat. Chem. Biol.上的文章，题目为“A de novo designed coiled coil-based switch regulates the microtubule motor kinesin-1”。通讯作者为布里斯托大学的Derek N. Woolfson, Mark P. Dodding和Jessica A. Cross。其中，Woolfson教授的研究方向为蛋白质折叠及蛋白设计。

设计具有构象开关功能的蛋白是具有挑战的。例如，从头设计的蛋白通常具有极端稳定的结构，往往不像天然蛋白一样具有构象间转换的动态能力。另一方面，蛋白的构象转换在细胞骨架运动蛋白中尤为重要，例如，kinesin-1是一种以异四聚体形式存在的微管马达，当无货物结合时，其处于一种自抑制构象。最近，作者团队解析了kinesin-1自抑制构象的结构，结果揭示了蛋白两个CC结构域间存在的柔性铰链结构，即肘状结构（elbow），该区域对复合体从折叠（λ）构象到打开构象之间的转变至关重要。本文中，作者尝试通过从头设计方法在该结构域处引入构象开关，从而实现对kinesin-1构象的灵活控制。

为了实现这一目的，作者计划向蛋白的CC2/CC3结构域间引入重新设计的elbow结构域（pA），它可以与从头设计的多肽配体（pB）结合，从而发生构象转变。作者首先用AlphaFold2预测了野生型kinesin的结构，结果显示AF2能够可靠地捕捉到kinesin WT的两态平衡。而对于kinesinΔElbow，AF2则给出完全打开的构象。这些预测都通过体积排阻色谱（SEC）实验得到了验证。

接下来，作者尝试通过从头设计elbow结构域实现对kinesin构象的静态控制。作者利用其此前开发的可视化卷曲螺旋结构域的软件Socket2，分析了kinesin在λ构象时elbow结构域中存在的卷曲螺旋、螺旋间和凹凸（knobs-into-holes）相互作用。结果提示其中5个残基的去除可有效地破坏elbow结构域的构象灵活性。AF2预测和SEC实验都证实了这种变体（Elbow Lock）被锁定在λ构象。随后，作者也成功用从头设计的elbow结构域（EL-CC-Di-IR）将蛋白锁定在开放构象。

基于上述成功的改造结果，作者尝试向elbow结构域中引入构象开关。作者选择了一种从头设计的的异源二聚体，其中两个单体分别记为pA和pB，二者的结合将形成稳定的反平行卷曲螺旋结构。通过精细调整pA在elbow结构域处的插入位置，作者成功设计了模拟天然kinesin的工程化蛋白EL-pA-Ala。同样地，AF2预测和SEC实验共同显示当EL-pA-Ala与pB结合时将发生从λ构象到开放构象的完全转变。作为直接的生物物理证据，作者通过小角X射线散射（SAXS）准确地表征了SEC实验中所提示的结构。

最后，作者在活细胞内测试了这种从头设计肽诱导的构象转换是否能实现对kinesin的变构激活。成像结果显示，处于λ构象的荧光标记kinesin在胞质内弥散分布，而处于开放构象的kinesin则具有微管定位。重要的是，在具有穿膜能力的肽pB处理下，EL-pA-Ala的亚细胞定位发生了显著改变，提示其在细胞内的变构激活。

本文作者：TYC

责任编辑：ZF

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01640-2

文章引用：DOI: 10.1038/s41589-024-01640-2