分享一篇发表在Nature Communications上的文章Alkylamine-tethered molecules recruit FBXO22 for targeted protein degradation。通讯作者是来自奥地利科学院分子医学研究中心的Georg E. Winter，他们组致力于蛋白靶向降解剂的开发以及研究癌症过程中的基因调控过程。
使用PROTAC或者分子胶技术进行蛋白靶向降解是一种有潜力的治疗策略。通过将目的蛋白和E3连接酶连接在一起，导致目的蛋白被泛素化而降解。但是近期研究中，也有一些看起来单独靶向目的蛋白的小分子也能执行降解功能，这暗示了潜在的新型E3连接酶的存在以及新的蛋白靶向降解思路。在本文中，作者筛选得到了一种脯氨酰异构酶FKBP12的降解剂，这是一种带有柔性烷胺链的小分子，作者对它的作用机制进行了研究。作者从FKBP12的PROTAC库中初步筛选并进一步优化得到了降解效率较佳的小分子SP3N，它仅有FKBP12的配体部分SLF和PEG3-NH2部分连接组成。当把氨基部分衍生为乙酰基（SP3NAc）后小分子不再有降解活性，这一现象和之前报道过的一些带有烷胺结构的降解剂类似，说明烷胺结构对降解的重要性。作者利用定量质谱证明SP3N在HEK293T细胞中特异性降解FKBP12，并通过外加小分子抑制剂证明这种降解依赖于泛素-蛋白酶体降解系统。为了进一步确定SP3N发挥降解功能所需要的细胞内效应蛋白，作者使用CRISPR/Cas9进行敲除筛选，并成功发现E3连接酶FBXO22的敲除显著抑制了SP3N的降解效果。后续，作者在抑制蛋白酶体的前提下利用免疫共沉淀以及纳米荧光素酶互补实验证明了SP3N介导的FBXO22与FKBP12复合体的形成，而SP3NAc则无法诱导复合体产生。此前研究表明，另一种带有烷胺结构的降解剂会在有胎牛血清FCS的细胞培养基中的胺氧化酶代谢为醛类再发挥功能。受此启发，作者者进行相应的测试，并发现SP3N也会经过FCS依赖的代谢转化成醛类物质SP3CHO，重组猪二胺氧化酶也有类似的转化效果。作者于是合成了SP3CHO，发现它比SP3N的降解效果更强；在重组的FBXO22与FKBP12体外环境中，SP3CHO能够更有效诱导FKBP12的多泛素化修饰，说明SP3CHO是SP3N转化而来的更活泼的活性代谢物。考虑到SP3CHO醛基的亲电性，作者猜测它可能和FBXO22产生共价修饰，在体外检测到了加合物产生的质量位移。作者进一步在FBXO22的C末端底物结合区域内突变了5个半胱氨酸，并回补到FBXO22的敲除细胞中，发现C326A突变无法恢复SP3N或者SP3CHO对FKBP12的降解；体外实验中，C326A的突变也抑制了SP3CHO对FBXO22的加和，也无法让FKBP12产生多泛素化修饰。总之，这些结果证明C326是SP3CHO的共价修饰位点，对形成FBXO22-FKBP12-SP3CHO三元复合物以及后续的泛素化和降解至关重要。最后，作者还比较了另外两个类似的带有烷胺的降解剂，发现他们也是通过靶向FBXO22来发挥降解功能的，说明设计带有烷胺基团的降解剂可能是一种通用方法。总之，本文发现一种带有烷胺结构的FKBP12降解剂SP3N，并证明了其代谢为活性醛结构并共价修饰FBXO22来发挥降解功能的作用机制，提出了一个通过引入烷胺结构来开发降解剂的新思路。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49739-3文章引用：DOI: 10.1038/s41467-024-49739-3
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