分享一篇发表在 nature chemical biology 上的文章，题目为“A CRISPR activation screen identifies FBXO22 supporting targeted protein degradation”。作者在此描述了一种基于成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 的转录激活筛选，重点关注人类 E3 连接酶，目的是识别可以促进异双功能化合物介导的靶标降解的 E3 连接酶。通过这种方法，确定了一种候选的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，22-SLF，当 FBXO22 基因的转录被激活时，它会诱导 FK506 结合蛋白 12 的降解。随后的机制研究表明，22-SLF 与 F-box 蛋白 22 (FBXO22) 中的 C227 和/或 C228 相互作用，从而实现靶标降解。最后，通过有效降解其他内源性蛋白质（包括含溴结构域的蛋白质 4 和棘皮动物微管相关蛋白样 4-间变性淋巴瘤激酶融合蛋白）证明了基于 FBXO22 的 PROTAC 的多功能性。

CRISPR 激活筛选可识别 FBXO22 用于 TPD

已证明，评估靶向双功能化合物是发现可能与新型内源性 E3 连接酶结合的功能性降解剂的有效方法。这些 E3 连接酶可以通过 CRISPR 敲除筛选或亲和纯化-质谱 (AP-MS) 来鉴定。然而，当候选降解剂可以结合的内源性 E3 连接酶表达量低或极小时，这种方法就会受到限制。因此，这些双功能化合物可能表现出部分靶标降解，使 E3 反卷积过程具有挑战性。在这种情况下，使用 CRISPR 激活筛选有可能通过增强所需 E3 连接酶的表达将这些活性低下的降解剂转化为活性过高的降解剂。对于初步研究，选择 FK506 结合蛋白12 (FKBP12) 作为底物蛋白，这是一种常用于研究配体诱导的蛋白质降解的脯氨酰异构酶。为了建立 CRISPR-Cas9 转录激活细胞，首先生成表达 FKBP12-EGFP的 HEK293T 细胞。使用来那度胺-SLF（Len-SLF；FKBP 的合成配体）确认了 FKBP12-EGFP 的降解，这是一种通过募集 CRBN12 靶向 FKBP12 的成熟 PROTAC。相反，单独的 FKBP12 结合剂 SLF 不会诱导 FKBP12-EGFP 的降解。 随后，在表达 FKBP12-EGFP 的细胞中，稳定表达了 dCas9-VP64 和 MS2-P65-HSF1。 该第二代 CRISPR-Cas9 转录激活系统结合了转录激活因子 VP64 以及其他辅激活因子 p65 和热休克因子 1 (HSF1)，从而增强了转录激活。为了验证基因转录激活的有效性，选择了一个研究充分的基因 IL1B，并生成了两个具有针对 IL1B 启动子区域的单向导 RNA (sgRNA) 序列的构建体20。用两种 IL1B sgRNA 转导表达 FKBP12-EGFP、dCas9-VP64 和 MS2-P65-HSF1 的细胞，导致 IL1B 基因表达显著增加。

22-SLF促进FBXO22依赖的FKBP12降解

接下来，在 HEK293T 细胞中稳定过表达 FLAG 标记的 FKBP12 和血凝素 (HA) 标记的 FBXO22，然后将这些细胞置于 22-SLF 中。结果表明，22-SLF 诱导的 FLAG-FKBP12 表达丧失依赖于 FBXO22，因为在缺乏 HA-FBXO22 的细胞中未观察到表达减少。值得注意的是，蛋白酶体抑制剂 MG132、neddylation 抑制剂 MLN4924 和 FKBP12 配体 SLF 可阻断 FLAG-FKBP12 表达丧失。这表明 FKBP12 被 Cullin–RING 连接酶 (CRL)22 蛋白酶体降解，这与 FBXO22 参与 S 期激酶相关蛋白1 (SKP1)–Cullin 1 (CUL1)–F-box 蛋白 (SCF) 泛素连接酶复合物（CRLs23 的一个亚家族）一致。SLF 的救援表明其与 FKBP12 结合位点的竞争性参与，表明 22-SLF 与 FKBP12 结合以进行降解过程。使用 11 种浓度的 22-SLF（范围从 0.025 至 15 µM）进行了剂量依赖性降解实验。通过该实验，确定了两个关键参数：Dmax 值（达到 89%）和半最大降解浓度 (DC50) 值（测量值为 0.5 µM）。此外，22-SLF 诱导的 FLAG-FKBP12 降解动力学很快，几乎在 2 小时内完成底物降解。总之，这些数据支持 22-SLF 将 FBXO22 募集到 FKBP12，从而导致 FKBP12 的蛋白酶体降解的机制。

FBXO22 C227 和 C228 介导 22-SLF 诱导的 FKBP12 降解

22-SLF 中的亲电 α-氯乙酰胺基团表明可能与 FBXO22 中的半胱氨酸残基相互作用。为了识别 22-SLF 所结合的 FBXO22 中的特定半胱氨酸，用 2 µM 22-SLF 处理表达 HA-FBXO22 的 HEK293T 细胞 2 小时。使用半胱氨酸定向活性蛋白质分析 (ABPP)，一种用于测量靶半胱氨酸结合的化学蛋白质组学技术，试图量化碘乙酰胺-去硫生物素 (IA-DTB) 修饰的半胱氨酸对 FBXO22 的阻断程度。 从 5650 个定量的 IA-DTB 修饰肽库中鉴定出 FBXO22 中的四个半胱氨酸 (C83、C117、C228 和 C365) ，其中约 20% 的 FBXO22 C228 被 22-SLF 处理阻断。人类 FBXO22 总共含有 14 个半胱氨酸，其中 10 个在人类和啮齿动物之间是保守的。 在 ABPP 实验中，量化了四个半胱氨酸，包括可能与 22-SLF 相互作用的 C228。观察到 22-SLF 对 FBXO22 的低分数参与度，这引发了一个问题：这种低参与度是由 22-SLF 的低细胞通透性还是 22-SLF 对 FBXO22 的低亲和力所驱动的。为了解决这个问题，我们通过测量 Len–SLF 对 FKBP12 降解的挽救来评估 22-SLF 对 FKBP12 的参与。在用 22-SLF 预处理的 HEK293T FBXO22 敲除细胞中，观察到剂量依赖性阻断 Len–SLF 诱导的 FKBP12 降解。这种阻断效果的半最大有效浓度 (EC50) 为 1.96 µM，表明在此浓度下，22-SLF 可能占据了 50% 的 FKBP12。 考虑到 ABPP 数据表明，在类似浓度（2 µM）下，22-SLF 可与约 20% 的 FBXO22 C228 结合，这些发现表明，低分数参与可能是因为 22-SLF 对 FBXO22 的亲和力低，而不是细胞通透性低。

22-SLF 诱导 FKBP12 和 FBXO22 之间形成三元复合物

已充分证实，降解剂与其靶蛋白和 E3 连接酶形成三元复合物是驱动后续靶蛋白降解的关键步骤。为了证明涉及 22-SLF、FKBP12 和 FBXO22 的三元复合物，用 22-SLF 和 MG132 处理表达 HA-FBXO22 和 FLAG-FKBP12 的 HEK293T 细胞。该实验表明，在 22-SLF 和 MG132 存在下，HA-FBXO22 与 FLAG-FKBP12 共免疫沉淀，支持三元复合物的形成。值得注意的是，当表达 FBXO22 C227A 或 C228A 单突变体时，该三元复合物的组装会受到部分阻碍，而当引入 FBXO22 C227A/C228A 双突变体时，该三元复合物的组装几乎完全消失。 为了全面评估 22-SLF 对 FKBP12 相互作用组景观的影响，使用 AP-MS 方法从用 22-SLF 处理的 HEK293T 细胞中鉴定与 FLAG-FKBP12 共免疫沉淀的蛋白质。该分析揭示了 FBXO22 复合物的几种蛋白质成分，包括 FBXO22、SKP1、CUL1、RBX1 和 NEDD8，作为 22-SLF 招募的蛋白质。 此外，进行了一项富集蛋白质组学研究，比较了表达 FBXO22 野生型和用 22-SLF 处理的 C227A/C228A 突变体的 HEK293T 细胞中的 FKBP12 相互作用组景观。该实验表明，FBXO22 复合物在表达 FBXO22 野生型的细胞中富集，但在表达 FBXO22 C227A/C228A 的细胞中没有富集。总的来说，这些发现表明 22-SLF 通过与 FBXO22 中的 C227 和/或 C228 结合，有效地驱动了涉及 22-SLF、FBXO22 和 FKBP12 的三元复合物的形成。

利用FBXO22降解其他蛋白质靶标

接下来，试图研究 FBXO22 促进其他蛋白质降解的潜力。首先研究了含溴结构域蛋白4 (BRD4)，因为它具有显著的生理作用，并且有选择性配体 JQ1 可用，后者在降解剂开发中得到了广泛的应用。通过将 FBXO22 结合部分与 JQ1 偶联，合成了一种化合物 22-JQ1 (3)。22-JQ1 促进了 A549 野生型细胞中 BRD4 的降解，而 FBXO22 敲除后，这种降解被消除。随后，对用 22-JQ1 处理的 A549 野生型和 FBXO22 敲除细胞进行了整体蛋白质组学分析。的研究结果表明，22-JQ1 在 A549 野生型细胞中诱导 BRD4 强效降解，但在 FBXO22 敲除细胞中则无此作用。为了进一步证明使用 FBXO22 降解其他靶标的潜力，合成了另一种 PROTAC，22-TAE (4)，其中结合了 FBXO22 结合部分和确定的间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 配体37。 在 H2228中生成了 FBXO22 敲除，H2228 是一种表达棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4)-ALK 融合蛋白的非小细胞肺癌细胞系。发现 22-TAE 诱导 H2228 野生型细胞中 EML4–ALK 融合蛋白的降解，而在 FBXO22 敲除的 H2228 细胞中未观察到这种降解。 总之，这些结果强调了 FBXO22 在创建能够降解多种蛋白质靶标的 PROTAC 方面的潜力。

本文作者：LRC

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原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01655-9

DOI：10.1038/s41589-024-01655-9