分享一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章“N-Acyl-N-Alkyl Sulfonamide Probes for Ligand-Directed Covalent Labeling of GPCRs: The Adenosine A2B Receptor as Case Study”，本文通讯作者为莱顿大学的Daan van der Es助理教授，他们课题组致力于细胞膜受体蛋白的共价配体设计。

G蛋白偶联受体（GPCR）是一个膜蛋白家族，参与了许多病理和生理过程。目前，小分子工具化合物在研究G蛋白偶联受体（GPCR）方面发挥着重要作用。然而，工具化合物通常占据正构结合位点（Orthosteric binding site），妨碍了配体结合后GPCR的功能研究。为了克服这一问题，人们开发了配体导向标记技术（Ligand-directed labeling），这种技术能使报告基团与GPCR共价结合，同时允许后续的正构配体结合。腺苷A2B受体（A2BAR）是一种典型的GPCR，由于其在肿瘤微环境中具有免疫抑制的作用，因此，抑制A2BAR是一种潜在的新型肿瘤免疫治疗策略。

在本文中，作者展示了A2BAR的首个配体定向探针的开发过程。他们报告了两种探针分子的合成过程，评估了它们与A2BAR的结合情况，并使用SDS-PAGE、流式细胞仪和质谱技术研究了所开发的配体定向探针是否能在活细胞上检测到A2BAR。将配体导向标记技术应用于腺苷A2B受体（A2BAR）。

作者此前已报道过基于氟磺酰基团的A2BAR共价拮抗剂1（LUF7982），并证实其共价标记A2BAR的K267、K269位点。基于上述反应基团与配体导向标记中N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）基团的相似性，作者将1改造为配体导向标记探针4a、4b，两者具有不同的报告基团碳链长度。

作者基于放射性配体置换实验，研究新探针与A2BAR的结合能力。共价拮抗剂1的亲和力随孵育时间延长而提高，与其不可逆的结合模式相匹配；与1相反，4a、4b在预孵育 4 小时后的亲和力都没有出现显著的时间依赖性增加，与配体定向标记的概念相符。对其他腺苷受体的进一步研究表明，4a、4b对A2BAR具有高亲和力和良好的选择性。

进一步，作者使用稳定表达A2BAR的CHO细胞，探究4a、4b处理对受体激活的影响。这里，作者使用共价拮抗剂1作为负对照，可逆拮抗剂PSB-1115作为正对照，以及NECA作为激动剂。当拮抗剂与激动剂共孵育时，所有小分子均抑制A2BAR激活；当预孵育拮抗剂，在清洗后再加入激动剂时，正对照组的A2BAR能够激活，负对照组保持抑制，而4a、4b处理组则介于两者之间。分子对接结果表明，报告基团在K267、K269位点的修饰对NECA结合有一定的阻碍作用，因此证实了实验结果。

使用4a、4b处理裂解后细胞膜组分，观察不到A2BAR对应的标记条带。使用探针标记活的CHO细胞，比较共价拮抗剂1、PNGase处理对于标记结果的影响。4a、4b均产生了多种标记条带。其中，4a可观察到 ~ 60 kDa处的弥散条带，而其他对照泳道中没有该条带；用PNGase去除N-聚糖后，60 kDa的条带变为~ 30 kDa处更窄的条带。与此前结果对比，可确定上述条带属于A2BAR。

最后，作者使用类似于SDS-PAGE的实验条件，对4a、4b标记蛋白进行富集以及蛋白质组鉴定。与3种不同对照条件分别进行比较，探针4a均富集了A2BAR。此外，也观察到脱靶蛋白，如核糖体蛋白 G3H1F4 和苹果酸脱氢酶 G3HA23。与此前结果一致，4b没有富集到A2BAR。

综上所述，本文基于此前已报道的共价配体，发展了A2BAR的首个配体定向探针。

本文作者：TZS

责任编辑：WYQ

原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.4c00210

文章引用：10.1021/acschembio.4c00210