近年来，免疫检查点抑制剂已经彻底改变了癌症治疗的方法。这些检查点作为免疫系统的“刹车”，防止对健康细胞的免疫攻击。然而，Alison和Honjo的开创性工作揭示了CTLA-4和PD-1作为癌症免疫治疗的目标蛋白，其中CTLA-4是FDA批准的抗体药物Ipilimumab（Ipi, Yervoy）的靶点。Ipilimumab通过阻止CTLA-4与其配体结合，激活免疫系统，使T细胞能够杀死癌细胞。然而，像许多抗体治疗药物一样，CTLA-4不仅存在于病变组织中，也存在于健康组织中，这可能导致与非肿瘤相关的CTLA-4相互作用，从而引发副作用。为了解决这一特异性问题，近十年来，肿瘤特异性抗体的开发取得了显著进展，其中抗体前药（pro-antibodies）是进展最为显著的一类。这些抗体前药通过掩蔽组的引入，在目标疾病组织的微环境中遇到上调的蛋白酶时才暴露出活性的抗体，从而最大限度地减少脱靶效应。（图1A-B）然而，当前的抗体前药设计仅限于通过融合蛋白的方法在抗体的N-端引入掩蔽组，这种方法只能使用标准氨基酸，限制了掩蔽组的多样性和引入位置的控制。
图片来源：JACS
本研究提出了一种基于钯催化的生物偶联方法，可以在抗体的互补决定区（CDR）内引入一种受保护的酪氨酸模拟物，作为一种新型的掩蔽组。以FDA批准的抗体药物Ipilimumab为模型，该方法可以引入一种与非标准聚合物（如聚乙二醇（PEG））结合的蛋白酶可切割的掩蔽组，使其在肿瘤相关蛋白酶存在下暴露出活性的酪氨酸模拟物（称为羟苯基半胱氨酸（HPC）），从而恢复其与目标抗原的结合能力。本研究通过钯催化的生物偶联方法，在抗体的特定位点引入受保护的酪氨酸模拟物，从而实现抗体前药的精准掩饰。研究团队首先优化了钯催化的偶联策略，使其能够在Ipilimumab的轻链（Y32C-LC和Y49C-LC）上高效地引入S-酪氨酸衍生物。（图2）使用胺基缓冲液和钯氧化加成复合物（Pd-OAC），在接近中性的pH条件下进行反应，确保了高转化率和防止蛋白质沉淀。
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研究过程中，通过凝胶过滤、蛋白A亲和色谱和疏水相互作用色谱等多种纯化技术，获得了高纯度的HPC变体，并进行了质谱分析，验证了在期望位置的特异性修饰。此外，通过表面等离子共振（SPR）实验，研究了HPC变体与CTLA-4的结合亲和力，证明了HPC作为酪氨酸的合适替代物，其对抗原结合界面的影响最小。在成功展示HPC作为酪氨酸替代物后，研究团队设计并合成了一种钯基生物偶联试剂，用于引入受保护的HPC。试剂设计中引入了一个5 kDa的PEG单元，通过固相肽合成（SPPS）和多步骤化学合成，成功制备了掩蔽抗体前药，并在肿瘤蛋白酶的存在下实现了掩蔽组的有效切割。本研究首次展示了在抗体的互补决定区（CDR）内通过钯催化的生物偶联方法引入受保护的酪氨酸模拟物，拓展了抗体前药设计的策略。这一创新方法不仅突破了掩蔽组仅限于抗体N-端的限制，还提供了对掩蔽组引入位置的精确控制，为抗体前药的进一步发展提供了新的工具和方法。这一方法的成功应用，有望显著提升抗体前药的治疗窗口，减少脱靶效应，从而提高抗体治疗的安全性和有效性。尤其在癌症免疫治疗领域，精准的掩饰和释放策略将为患者提供更为个性化和安全的治疗方案。此外，该方法还为探索新的掩蔽组和修饰位置提供了可能，推动了生物药物领域的创新和发展。
标题：Site-Specific Antibody Prodrugs via S-Arylation: a Bioconjugation Approach Toward Masked Tyrosine Analogues
作者：Jason Tao, Heemal H. Dhanjee, Michael W. Gribble Jr, Veronika Kottisch, Jacob Rodriguez, Joseph S. Brown, Holly Schmidt, Juhi Juneja, Fabienne Denhez, Peter S. Lee, Daša Lipovšek, Stanley Krystek, Yihong Zhang, Patrick Bousquet, Yong Zhang*, Bradley L. Pentelute*, and Stephen L. Buchwald*
链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c04035
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