分享一篇发表在Bioconjugate Chemistry上的文章，标题为 “Oriented Antibody Coupling to an Antifouling Polymer Using Glycan Remodeling for Biosensing by Particle Motion”, 文章的通讯作者是来自埃因霍温理工大学分子生物传感应用系的Menno W.J. Prins教授；Menno W.J. Prins教授致力于开发在复杂的大分子环境（如血浆）中以单分子分辨率检测蛋白质和研究蛋白质功能的技术。本文主要展示了一种实现抗体与聚（l-赖氨酸）-接枝聚（乙二醇）（PLL-g-PEG）基质定向偶合的方法，利用聚糖重塑来创建抗体-DNA共轭物。在本文中，作者开发了一种策略，在聚合物上实现定向抗体偶联，以实现连续生物传感目的。
定向偶联是通过重塑抗体聚糖产生抗体-ssDNA偶联物来实现的，然后杂交到ssDNA偶联到固体基质上的聚（l-赖氨酸）-接枝聚（乙二醇）（PLL-g-PEG）涂层上。在具有单分子分辨率的连续生物传感技术中使用抗降钙素原抗体来展示偶联策略，称为粒子运动生物传感（BPM）。降钙素原（PCT）是一种炎症生物标志物，用于区分患者是否为细菌或病毒感染，并监测患者抗生素治疗后的反应。作者研究了抗体修饰方法和抗体取向，展示了抗体在BPM生物传感器中的实现策略。本研究的目的是通过修饰聚糖并通过DNA连接到聚合物，以定向方式偶联抗体。使用GlycoConnect（图1）创建Ab-DNA偶联物，使Fab位点完好无损。首先，用内切糖苷酶SH修剪聚糖，然后，UDP-GalNac6N3通过半乳糖基转移酶（Y289L）与剩余的N-乙酰氨基葡萄糖相连。最后，通过DBCO-ssDNA与叠氮化物糖发生SPAAC点击化学反应，实现了DNA与抗体的偶联。将抗体固定在用聚合物PLL-g-PEG/N官能化的底物上，通过将DBCO-ssDNA与底物上的叠氮化物进行SPAAC点击化学反应，然后使用两条中间ssDNA链将Ab-DNA与底物上的DNA杂交，从而实现固定化（图1）。首先使用曲妥珠单抗测试和优化修饰策略，该修饰被应用于抗PCT抗体。曲妥珠单抗因为它的大量可用性被用于初始研究，并且其Fc片段与抗PCT抗体的Fc片段相似。使用液相色谱/质谱（LC-MS）和SDS-PAGE评估Ab修饰的产率。对于曲妥珠单抗的重塑，当将4 mol当量的DNA与Abs结合时，聚糖重塑率达到81%，Ab-DNA偶联率达到65%。抗PCT抗体修饰的结果如图2所示。
接下来，根据Tholen等人最近发表的一种方法，使用蛋白质G和蛋白质M量化抗体在颗粒上的取向。作者将成像方法应用于与链霉亲和素功能化二氧化硅颗粒偶联的抗体，因为这些抗体在DNA-PAINT中具有良好的成像特性。将颗粒固定在底物上，并使用双色DNA-PAINT对颗粒上抗体的可及Fab和Fc结构域进行成像。成像是通过用蛋白G-ssDNA偶联物靶向Fc结构域和用蛋白M-ssDNA偶联物靶向Fab结构域来实现的（图3）。偶联的ssDNA 链可作为对接链，用于DNA-PAINT成像。该成像技术利用染料标记的互补成像仪ssDNA链的瞬时结合和解结合，以纳米级分辨率定位对接链的位置。用Cy3B（绿色）和ATTO-647N（红色）染料对ssDNA成像链进行功能化，以便分别定位与蛋白质M和蛋白质G偶联的对接链，以定量颗粒底物上暴露的Fab和Fc结构域的比例（图3）。图3 单分子DNA-PAINT研究与二氧化硅颗粒偶联的抗体取向
接着以降钙素原为模型进行研究，以颗粒运动生物传感为读出方法，研究了与PLL-g-PEG涂层偶联的Ab-DNA偶联物的生物传感功能。在实验中，使用暗视野显微镜跟踪了数百个颗粒的运动，并根据其扩散率对颗粒进行了表征（图4）。扩散率低（D < 0.15 μm2/s）的颗粒被表征为结合颗粒，而扩散率高（D > 0.15 μm2/s）的颗粒被表征为非结合颗粒。如图1所示，采用夹心传感器的形式，使用生物素化的Abs对颗粒进行功能化，使用Ab-DNA 共轭物对底物进行功能化。图4 在基于粒子运动（BPM）的生物传感器中研究抗体功能
最后通过比较两种不同的底物功能化方法来评估非特异性结合的程度：杂交到聚苯乙烯PLL-g-PEG涂层上的定向Ab-DNA共轭物和吸附在玻璃上的非定向Abs物理吸附（图4）。在BPM传感器上测得的与PLL-g-PEG 上的Ab-DNA 共轭物和物理吸附的Abs的结合分数分别为0.12和0.26。对于含有Ab-DNA共轭物的传感器，结合态的扩散直方图显示出三个峰的模式，随着扩散率的增加，峰高也在增加，这表明一些粒子具有单分子键，而另一些粒子具有多分子键。物理吸附Abs的传感器显示出结合粒子的扩散率分布很广，在扩散率为零时有一个明显的高峰，表明许多粒子根本没有运动。与物理吸附的Abs相比，与PLL-g-PEG杂交的Ab-DNA结合物底物显示出较少的多价相互作用和非特异性相互作用。非特异性相互作用较少的原因可能是使用了防污PLL-g-PEG涂层。综上所述，作者介绍了一种实现抗体与基底定向偶联的偶联方法，并使用降钙素原免疫传感器展示了其生物传感功能。这种定向耦合是通过重塑抗体聚糖使其含有叠氮化物、通过SPAAC点击化学连接ssDNA以及通过DNA杂交将抗体-DNA共轭物耦合到PLL-g-PEG底物上实现的。同时定向偶联方法将成为设计新型抗体生物传感器的灵活途径。
文章作者：LT
DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.4c00196
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