分享一篇发表在Nature Biotechnology上的文章：Template-independent enzymatic synthesis of RNA oligonucleotides，通讯作者是哈佛医学院的George M. Church和Erkin Kuru，前者课题组主要发展新型生物技术用于核酸及蛋白的检测及合成。这篇文章作者发展了一种酶法从头合成RNA寡核苷酸的手段。
人工合成RNA技术对于RNA疗法的开发有着重要意义，目前最为常用的手段是亚磷酸酰胺法化学合成，但这一方法需要用到大量易燃的有机溶剂，限制了其工业规模，并且这一方法由于需要大量保护基团，合成路线的原子利用率很低，因此本文作者希望开发一种酶法合成RNA的新技术来解决上述问题。
作者使用裂殖酵母来源的CID1 polyU聚合酶的突变体作为流程中的合成酶，这一突变体可以在10nt长度的特定起始序列的基础上，将带保护基团的NTP连接到起始序列上，随后产物可在温和条件下脱保护，并进行下一轮的连接。合成结束后，可以使用酶将整个RNA从固相固定的起始序列上切割下来。
作者对保护基团的种类和位置进行了研究，他们考虑到烯丙基保护基具有较小的体积，能够在不影响polyU聚合酶活性的基础上在Pd催化下温和地脱除，因此使用烯丙基作为保护基。此外由于聚合酶的活性依赖于3’-OH，因此作者将烯丙基保护在NTP的3’位置，这一设计也为后续合成2’位置衍生的非天然RNA提供了可能。作者通过质谱检测发现，酶催化之后连接反应的效率可以达到95%，四种NTP均能被成功连接，且反应所需时间小于1min。
作者随后测试了二轮，五轮以及十轮的连接反应，虽然十轮连接后产物纯度下降到了67%，但质谱结果表明主要产物的质量与预期是吻合的。作者还对2’位置氟代或甲氧基等基团取代的非天然RNA合成进行了测试，发现聚合酶的确能够成功识别对应的NTP原料并进行成功的连接。
最后，作者对起始序列的切除方法进行了研究，他们发现使用Ecoli的核酸内切酶V能够从肌酐下游的两个碱基处进行切割，因此可以使用预先设计好的带肌酐的起始序列，或可以通过直接合成的方式将肌酐引入到序列之中，最后实现酶切对起始序列的去除。此外作者也对固相载体进行了改进，在CPG微孔玻璃的基础上添加了PEG5-NHS用于与起始序列连接，并通过实现对整套合成体系的效果进行了测试。总之，这篇文章发展了一种酶法从头合成RNA的手段，相比于目前常用的化学合成而言需要的保护基更少，条件更温和，且易于引入2’位置的修饰。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02244-wDOI：10.1038/s41587-024-02244-w
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