分享一篇发表在JACS上的文章：Elusive Protein–Glycosphingolipid Interactions Revealed by Membrane Anchor-Assisted Native Mass Spectrometry，通讯作者是来自阿尔伯塔大学的John S. Klassen教授，课题组的研究方向是基于质谱技术的开发和应用，并对蛋白质组装、蛋白-配体相互作用等进行研究。
细胞膜上的糖结合蛋白(GBPs)和鞘糖脂(GSLs)之间的相互作用涉及许多生物过程。使用可溶性模型膜进行天然质谱(nMS)是鉴定GBP配体的一种有效方法，但GBP-GSL弱相互作用的检测仍然具有挑战性。本文作者开发了膜锚辅助天然质谱法（MEmbrane ANchor-assisted nMS, MEAN-nMS）用于检测低亲和力GBP-GSL复合物。该方法的灵感是来自作者最近的研究结果（Anal. Chem. 2020, 92, 3923– 3931），当与高亲和力配体一起存在时，低亲和力GSL配体可以通过一种称为异多价结合的过程显著增加和GBPs的结合。通过MEAN-nMS来检测GBP–GSL复合物，也可以使用捕获和释放(catch-and-release，CaR)策略来鉴定配体(MEAN-CaR-nMS)，该过程中GSL在nMS碰撞后会从GBP-GSL复合物中释放出来。MEAN-(CaR)-nMS的工作流程如下：首先通过NHS酯和GBP伯胺反应引入DBCO点击化学基团，另外作者还人工制造了模型纳米片nanodiscs (NDs)用于模拟细胞膜，膜成分含有azidoPE并形成azidoPE-ND，通过DBCO和azido的无铜催化点击化学反应把GBP和膜锚定在一起。将GBP锚定在ND表面导致GBP附近GSL的有效浓度增加，从而促进两者的结合。在ESI过程中，GSL结合的GBP复合物[GBP + j(DBCO-PE) + GSL]由于多电荷的GBPs存在和ND之间的库仑斥力导致它从膜上解离，从而进行质谱检测。进一步地可以使用MEAN-CaR-nMS，即将[GBP + j(DBCO-PE) + GSL]复合物分离出来后进行CID碎裂，利用MS检测释放出来的GSL离子。作者为了将MEAN-(CaR)- nMS应用于细胞，他们将细胞悬浮液用含有azidoPE的ND孵育，并对混合物进行超声处理以破坏细胞膜并促进azidoPE的掺入，接下来用同样的流程鉴定GSL配体。为了证明MEAN-nMS检测模型膜中GSL配体的可靠性，作者将8种神经节甘脂(GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GT1a和GT1b)分别掺入azidoPE-ND中，并对DBCO标记的人半乳糖凝集素3的C端糖识别结构域(GAL-3C)进行筛选。半乳糖凝集素是一类重要的免疫凝集素，它识别具有末端β-半乳糖(Gal)残基的聚糖，有证据表明GAL-3能和GM1结合。作者通过测量神经节苷脂寡糖和GAL-3C的亲和力，发现GAL-3C的确能结合GM1，而缺乏末端Gal的GM2和GD2未被GAL-3C识别。利用MEAN-nMS，作者能够检测到GAL-3C与GM1的复合物，但未观察到与GM2或GD2结合，这与亲和力数据一致，说明了该方法的可靠性。综上，本文作者开发了一种针对难以捉摸的蛋白-鞘糖脂相互作用的检测方法。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c05805原文引用：10.1021/jacs.4c05805
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