分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目是“On-Demand Thio-Succinimide Hydrolysis for the Assembly of Stable Protein–Protein Conjugates”。文章的通讯作者为英国剑桥大学化学学院Gonçalo J. L. Bernardes教授。

蛋白质偶联物通过将两种天然蛋白质结合成单一支架，在生物技术和生物制药领域扮演着日益重要的角色。传统上，这些偶联物主要通过融合蛋白的重组表达获得，但这种方法存在一些限制，如N-C末端连接的限制、错误折叠的风险、低表达量以及组成蛋白系统的不相容性，这些问题阻碍了共表达。作为一种替代策略，翻译后蛋白偶联技术允许独立表达的蛋白质在翻译后连接，这种方式不仅克服了N-C末端偶联的限制，增加了拓扑多样性，而且能够在不同的宿主中产生不兼容的蛋白组分，使得一些难以通过传统重组表达方式获得的蛋白质偶联物成为可能。这种翻译后方法包括酶催化和基于标签的技术、非天然氨基酸与生物正交反应的结合，以及异双功能和同双功能化学连接策略，其中后者因其简单的连接子合成和应用广泛而受到欢迎。

半胱氨酸残基与马来酰亚胺试剂的选择性Michael加成反应是生产蛋白-蛋白偶联物相对可靠的反应。然而，马来酰亚胺的逆Michael解偶联和随后被内源性硫醇捕获导致所得偶联物的降解，使得目前所使用的马来酰亚胺试剂并不适用于产生稳定可控的蛋白-蛋白偶联物。作者认为双马来酰亚胺试剂在制备稳定的蛋白质-蛋白质偶联物时，必须满足三个关键条件：（1）其与硫醇的反应动力学需要与第一代马来酰亚胺保持一致；（2）硫代琥珀酰亚胺的开环水解应在几分钟到几小时内完成，以确保形成稳定的偶联物；（3）未反应的马来酰亚胺应最小程度或可控地开环水解为无反应性的马来酸。因此本研究开发了一种同源双功能连接策略（图1），以不易水解的马来酰亚胺形式代替原本可以自水解的马来酰亚胺，构建复杂的蛋白质-蛋白质偶联物，从而满足第一和第三个标准。在应用外部触发因素时，通过硫代琥珀酰亚胺的快速开环水解，所得偶联物可以完全稳定，从而满足第二个标准。

研究首先确定了一种合适的自稳定马来酰亚胺来暂时抑制马来酰亚胺水解，而仅在在施加外部刺激时触发硫代琥珀酰亚胺水解。由于硫代琥珀酰亚胺附近的质子化胺的感应吸电子效应是加速水解的主要驱动力，因此考察了将氨基保护来暂时抑制水解。通过对马来酰亚胺衍生物1，2，3（图2）对比，得出对硫代琥珀酰亚胺附近的酰胺键的吸电子作用促进水解，另一方面，羧基阴离子（马来酰亚胺3）具有抑制水解的电子供体效应，提高了马来酰亚胺衍生物的稳定性。

由于酰胺基团是一种促进水解的取代基，因此很明显，消除其效应是最小化预共轭水解的关键。为了解决这个问题，我们用氨基甲酸酯保护的仲胺合成了一种替代马来酰亚胺衍生物，与马来酰亚胺氮（马来酰亚胺4）相距两碳（图3a）。在相同条件下，马来酰亚胺 4 在 8 小时后水解率低于 10%（图 3a）有了足够稳定的马来酰亚胺，我们假设马来酰亚胺 4 的衍生物可以使用不稳定的保护基团暂时掩盖。使用生物偶联相容的触发器，设想可以随后去除氨基甲酸酯，从而揭示出一个吸电子的仲胺基团。为了探索这一点，合成了马来酰亚胺 5、6 和 7，分别具有化学、光化学和酶促脱保护触发器。发现所有三个氨基甲酸酯基团都赋予马来酰亚胺与4一致的稳定性，在相同条件下（pH 7.0，NaP我，20mM，25°C）（图3a）。马来酰亚胺5–7与含半胱氨酸的五肽（Ac-LVCAF-NH2）进行反应，并通过HPLC-MS评估胺脱保护和硫代琥珀酰亚胺水解率。实验中，源自马来酰亚胺5的肽基-硫代-琥珀酰亚胺含有一个二硫键，在加入TCEP后，通过硫醇酯环化启动胺脱保护（图3 b）。进一步由5和6衍生合成了同源双功能的双马来酰亚胺试剂(图3 c)。

本文选择了PD-L1和HER2作为与插入在C端区域的游离半胱氨酸残基反应形成同源（图4 a, b）和异源（图4 c）二聚化方案的模型蛋白，通过实验发现结合产生的二聚体的功能大于其组成部分。

同时，三聚及四聚体的组装也被证实是有效的（图5 a）。其次，基于光催化脱保护的马来酰亚胺 6 的同型双功能连接子通过组装得到稳定的 IgG/sdAb 抗 HER2/PD-L1 双特异性构建体进一步证明了适用性（图5 b）。

综上所示，按需水解马来酰亚胺提供了一种强大的化学驱动翻译后蛋白-蛋白偶联方法，既克服了蛋白-蛋白偶联问题，又能完全控制马来酰亚胺和硫代琥珀酰亚胺的稳定性。双马来酰亚胺试剂在合成稳定的蛋白-蛋白偶联物中有很大的潜力。

原文链接：https://testpubschina.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c03721