分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章“A Photocrosslinking Probe to Capture the Substrates of Caseinolytic Protease P”，本文的通讯作者是来自慕尼黑工业大学自然科学学院的Stephan A. Sieber教授。他曾师从Christopher T. Walsh教授进行博士研究，并跟随Benjamin F. Cravatt教授进行博士后训练。这篇文章中作者开发了三功能化学平台，发现了基因工程外的细菌丝氨酸蛋白酶底物。
酪蛋白水解蛋白酶P（ClpP）在细菌稳态中起着重要作用，它在ATP酶的帮助下去除受损或错误折叠的蛋白质，具有广泛的底物范围。受损蛋白首先被底物识别，然后被展开并进入ClpP的十四聚体桶中。催化活性丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸三联体切割肽键，根据生物体的不同，产生6至13个氨基酸残基的片段。然而，目前仍不清楚其对底物的识别序列、或PTM标签，从而难以使用生物信息学方法预测底物范围。因此，对其底物的发现主要依赖于蛋白质组学方法。此前已经通过突变ClpP活性位点的方法仅保留其对底物亲和力，并结合LC-MS方法对寻找底物。在这篇文章中，作者提出了不依赖基因工程的分析方法，即设计一种三功能化学平台，用于结合活性丝氨酸、对底物进行光交联及富集，然后使用化学蛋白质组学平台对ClpP底物进行寻找。首先，作者设计了活性丝氨酸位点的结合分子。他们基于此前研究的β-内酯和苯酯化合物提出了两种结合分子（trap 1 & trap 2），然后证明了这两种化合物与ClpP活性位点结合（图1A右）、保持蛋白水解活性（图1B）并具有很好的选择性（图1E）。然后，作者将其设计为三功能分子，在静止期、指数增长期及热激状态下对金黄色葡萄球菌蛋白质组进行化学蛋白质组学分析（图2A）。其中在静止期发现了少数底物，在指数增长期发现了更多底物（134种）（图2B），在热激状态下额外发现了35种底物（图3B）。其中20%是已知的ClpP底物，证明了方法的可信性。接下来作者对底物进行了验证，首先使用ClpP活性位点突变的细菌捕获底物蛋白。相比于野生型，突变型中底物蛋白更加稳定；其次使用PRM方法对八种鉴定到的底物蛋白进行验证（图4C）。总之，这篇文章使用化学蛋白组学策略进行蛋白底物发现，可以作为基因工程策略的补充。展望未来，该技术有可能通过为感兴趣的单个酶定制核心支架，扩展为捕获丝氨酸蛋白酶底物的通用即插即用工具。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202409220文章引用：doi.org/10.1002/anie.202409220
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