分享一篇JACS上的文章“Controlled Reversible N-Terminal Modification of Peptides and Proteins”。通讯作者是来自国科大杭州高等研究院以及中科院上海药物研究所的博士后刘博、黄河研究员和黄蔚研究员。
开发针对蛋白的可逆化学修饰方法能够帮助对蛋白功能的研究和调节，目前也已有多种针对蛋白上不同氨基酸进行的可逆化学修饰的方法。而在针对蛋白或肽段N末端可逆化学修饰方面，目前只有针对N-末端半胱氨酸的可逆修饰方法。在本篇文章中，作者通过使用过渡金属催化剂钯实现了对多种N-末端肉桂酰化的可逆调节，为研究N末端蛋白质组学提供了新的方法工具。作者首先在中性水溶液环境中检测了在醋酸钯催化下苯丙氨酸和多种丙烯基小分子的反应性，发现其中含有肉桂酰基的底物能够顺利在苯丙氨酸的N末端产生修饰。进一步测试表明，这种钯催化的苯丙烯基修饰仅会在半胱氨酸侧链上发生副反应，而不会和其他亲核氨基酸的侧链反应。作者设计了一条包含所有20种经典氨基酸的二十肽，并将上面半胱氨酸进行烷基化封闭，最终在这条肽上实现了N末端的苯丙烯基修饰，产率为52%。此外，作者也在AAF三肽上进行了标记条件的优化，优化后的N末端修饰产率可达90%。作者还测试了N末端的氨基酸对肽段修饰效率的影响，发现通过优化反应条件，所有的氨基酸都能有80%以上的标记效率（半胱氨酸的侧链仍然需要被封闭）。这一反应在多种生物来源的肽段上也可以实现，从而证明了该方法的底物适用性。后续，作者将这一方法用于蛋白的标记上。首先使用了序列较短的核糖核酸酶RNaseA进行实验，发现在37℃ 10小时的反应后，修饰率达到了83%，且修饰仅发生在N末端；在含有聚糖成分的RNaseB以及体积稍大的HER2和PD-L1的纳米抗体上，这一反应也有比较好的修饰率。作者还成功实现了对曲妥珠单抗两条轻链的N末端修饰，并在苯丙烯基小分子进一步衍生了荧光标签，从而实现在活细胞上进行对HER2的识别和荧光成像。最后，作者尝试对这种修饰进行可逆的去除，发现1,3-二甲基巴比妥酸可以在钯催化下快速去掉模型肽以及蛋白上的修饰，去除反应的转化率也不会受到N末端氨基酸的影响。其中，曲妥珠单抗在N端被修饰后对目标蛋白的亲和力降低，而在去修饰后亲和力恢复，从而表明这种N端可逆修饰能够帮助调节蛋白的功能。此外，作者还检测了这种N端标记的方法在N端组学中应用的潜力，设计了在苯环上含有叠氮基团的探针，发现探针可以在蛋白质组上产生标记信号，并用质谱实验证明其鉴定效果和已知的2-PCA探针的鉴定效果类似。总之，作者通过钯催化剂实现了对蛋白质N末端的可逆苯丙烯基修饰，并有潜力用于抗体功能调节以及N端组学的研究之中。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c04894
文章引用：10.1021/jacs.4c04894
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