稿：方昊明，北京大学

本期的推送将和大家分享一篇发表于 ACS Chemical Biology 上的文章。文章的英文标题是“Development of an Acrylamide-Based Inhibitor of Protein S‐Acylation”。这篇文章的通讯作者是来自于美国芝加哥大学的 Bryan C. Dickinson 教授。在这篇文章中，作者介绍了基于丙烯酰胺构建的蛋白质棕榈酰化修饰抑制剂的构建与开发，并阐明了该抑制剂（CMA）相比于之前开发的 2BP，有更低的细胞毒性与较低的酰基化蛋白硫酯酶（APT）抑制性。 

蛋白质棕榈酰化修饰是通过硫酯键将长链脂肪酸连接到蛋白质半胱氨酸硫醇上的修饰过程。棕榈酰化修饰是由蛋白质酰基转移酶（DHHC）催化，而长链脂肪酸的去除是由酰基蛋白质硫酯酶（APT）催化。DHHC 的主要催化原理是通过活性部位的硫代半胱氨酸进攻脂肪酰基辅酶 A 硫代酯，产生自酰化的 DHHC。然后，脂肪酰基链从半胱氨酸转移到蛋白质底物。2BP 是目前较为常用的 DHHC 抑制剂。然而，2BP 抑制至少两种 APT：APT1 和 APT2，并且具有相对较高的细胞毒性。在本文中，作者探究并开发了一种基于丙烯酰胺的 DHHC 抑制剂 CMA。

图1. CMA 设计概念

首先基于丙烯酰胺的两个优点：1. 丙烯酰胺与半胱氨酸硫醇反应更快；2. 不会与反应性和非特异性酰基辅酶 A 中间体发生反应。作者开发并研究了 14 种不同结构的基于丙烯酰胺构建的 DHCC 抑制剂。首先，通过合成出抑制剂 1，作者发现了基于丙烯酰胺结构构建的抑制剂对于 DHHC 的抑制性，但是相比于 2BP，抑制剂 1 有较为明显的活性降低。因此作者继续对抑制剂进行结构层面的优化。首先通过缩短碳链的长度，作者构建了抑制剂 2，但此抑制剂完全改变了其对于 DHHC 的抑制性。因此作者转而关注对于丙烯酰胺部分的改进。接下来，作者将原有的 R2 部分用丙烯酰胺（acrylamide amine）或丁烯酸修饰酰胺（butenoic acid-modified amid）取代并与不同结构 R1 组合从而合成了剩下的 13 种抑制剂。从图 2 中我们可以看出，在所有 13 种抑制剂中，只有 CMA 和抑制剂 8 相比于模板抑制剂 1 有较为明显的 DHHC 抑制作用。

图 2. 14 种不同基于丙烯酰胺构建的 DHCC 抑制剂及其对应的相对荧光偏振数值

同时通过对比这两种类似结构的抑制剂的 IC₅₀ 值（图 3），作者发现 CMA 有较为低的数值。因此，作者用以上方法证明，CMA 相对于其他 13 种抑制剂有相对明显的优势。同时在对 CMA 动力学参数的研究方面表明，与 2BP 相比，CMA 具有较快的反应效率与较高的结合力。

图 3. 2BP 抑制剂、模板抑制剂 1 与其两种优化抑制剂衍生物（CMA、8）IC₅₀ 值对比

随后，作者还对 CMA 的 APT 抑制性与细胞毒性进行了测评。首先，在对 APT 的抑制性方面，作者通过使用荧光探针 DPP-5 来表征两种 APT（APT1，APT2）的活性，结果表明（图 4），在通过对 2BP/CMA 与 APT1/APT2 共孵育的情况下，CMA 组在不同浓度下，相比于 2BP 都体现了对于两种 APT 的较低抑制水平。

图 4. 2BP 与 CMA 对 APT 的抑制情况对比

其次，在对于细胞毒性的方面，作者通过用 MTS assay 量化评估了在使用 CMA/2BP 的情况下，对三种不同细胞系 MDA-MB-231，HEK293T 与 3T3-L1 的生存能力的影响。通过图 5 表明，CMA 在一个明显高于 2BP 的浓度下，才对细胞系的生存能力有负面的影响。这一结果表明，CMA 的确相对于 2BP 而言，有一个较低的细胞毒性。

图 5. 2BP 与 CMA 细胞毒性对比

随后，为了验证 CMA 的功能性，作者通过使用 17-ODYA 对棕榈酰化蛋白进行代谢标记，并用荧光染料 TAMRA-azide 对以标记的蛋白进行荧光显色。在 SDS-PAGE 结果中，作者观测到了在 CMA 与 2BP 组，随着抑制剂浓度的增高，条带的荧光强度都有对应的减少趋势，因此说明了 CMA 具有与 2BP 相同的蛋白质棕榈酰化修饰的功能性。 

最后，作者也验证了 CMA 对蛋白质棕榈酰化修饰的抑制性对于 DHHC 底物之一 EGFR 的信号通路或是免疫代谢糖蛋白 CD36 的活性，表明 CMA 在生物研究中的重要作用。 

综上，作者首先通过利用丙烯酰胺的优势构建了 14 种不同的蛋白质棕榈酰化修饰抑制剂，并通过不断优化，筛选出 CMA 作为拥有最优结构的抑制剂。并在 APT 的抑制性与细胞毒性层面验证了其相比于 2BP 抑制剂的优势。

ACS Chem. Biol. 2021, DOI: 10.1021/acschembio.1c00405

Publication Date: July 26, 2021

https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00405

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