分享一篇Cell Chemical Biology上的文章：Chemoproteomics reveals immunogenic and tumor-associated cell surface substrates of ectokinase CK2α，通讯作者是UCSF的James A. Wells教授，他们课题组主要发展化学生物学技术来研究细胞对胞外蛋白质组的调控机制。这篇文章作者开发了一套鉴定胞外激酶膜表面底物的化学蛋白质组学流程，并对这些膜表面磷酸化底物的免疫原性进行了研究。肿瘤的代谢异常会导致肿瘤微环境中ATP的含量比正常组织高10000至100000倍，这些ATP可以被胞外激酶作为底物来对蛋白进行磷酸化，这些发生在胞外的磷酸化修饰可能会参与调控免疫系统的识别。此前的研究中曾利用磷酸化组学等手段鉴定到了几十个肿瘤细胞的胞外磷酸化底物，但作者推测实际存在的磷酸化底物远不止这个数目，因此作者希望开发一种化学蛋白质组学手段来系统性地对肿瘤细胞胞外激酶的磷酸化底物谱进行鉴定。作者选择了已知在胞外具有活性的CK2激酶作为研究对象，为了使CK2能够有效对膜蛋白进行磷酸化，他们融合表达了CK2的激酶结构域CK2α与能够靶向HER2抗原的ZHER2蛋白，使得CK2α可以被固定到带有HER2抗原的癌细胞膜上。为了实现对CK2α底物的富集，作者使用不透膜的γ-硫代ATP(ATPγS)作为底物来对膜蛋白进行修饰，随后利用非天然的硫代磷酸，使用碘乙酰胺偶联的beads对底物蛋白进行富集，最后经过on-beads酶切再对富集到的底物蛋白进行质谱鉴定。他们还添加了一组无活性的CK2α作为负对照，最终鉴定到了14个在实验组中显著富集的蛋白，除了已知会自磷酸化的CK2α外，他们还对新鉴定到的CD44，galectin-3以及CD109进行了逐一验证，并发现CD44的磷酸化发生在S183，S185以及T174上。此外为了确认这一方法能够被用于细胞内源激酶的底物谱上，他们尝试不进行外源表达，而是使用CK2α抑制剂处理来抑制其活性，并比较在加抑制剂前后富集到的磷酸化底物的变化，最终鉴定到了3个抑制剂处理后磷酸化水平显著下降的蛋白，其中包括CD44，说明这一方法有鉴定内源激酶磷酸化底物的能力。为了验证CK2α引入的膜蛋白磷酸化修饰是否会影响免疫反应，作者将热杀后的经过膜表面CK2α磷酸化后的hHER2+EMT-6细胞对小鼠进行免疫，收集血清后发现其中抗体对于CK2α处理后的hHER2+EMT-6结合能力的确变强，说明有抗体的生成。随后作者通过对Protein A/G的富集鉴定到了200多个这一过程中新生成的抗原，其中包括CD44，并通过酵母展示技术找到了靶向pCD44的抗体序列。最后，他们发现在这一免疫过程中CD4+ T细胞被激活而CD8+ T细胞则没有，这一结果也解释了免疫过程中抗体的大量产生但没有产生肿瘤的杀伤。总之，这篇文章开发了一种鉴定胞外激酶膜表面底物的化学蛋白质组学策略，并对这些磷酸化底物的免疫原性进行了一定探究。原文链接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/abstract/S2451-9456(24)00320-9文章引用：DOI：10.1016/j.chembiol.2024.07.018
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