多通道单分子检测已经在各个领域引起了广泛关注，例如并行检测生物标志物、监测多种分子的动态过程、多通道超分辨率成像、以及药物发现和筛选等。现有的多通道检测方法，主要是通过基于荧光技术的单通道串联来实现的复用检测，通常可以实现四通道的并行检测，但对于更高需求的多重检测则需要非常复杂的设计和配置，难以实现。同时，主流的检测方法一般是通过对荧光点的计数来实现的定量检测，在实际检测中，容易受到基质中荧光分子的干扰而产生假阳性信号，从而影响单分子计数结果的准确性等。因此，开发出一种能够实现多通道单分子检测的定量分析成像方法在单分子检测领域有巨大的应用潜力。在此，南方科技大学郝瑞课题组开发了一种定量的基于电化学荧光的成像方法，在碳化硅（SiC）纳米薄膜修饰的氧化铟锡（ITO）透明电极上直接实现多通道单分子计数。作者利用该纳米薄膜在较低的电位范围内通过质子耦合电子转移控制局部pH，在更高的电位下进一步诱导染料分子的直接电化学氧化，实现了在不同pH和氧化还原行为下的荧光-电化学调控。该方法实现了非信号放大的直接单分子计数，在皮摩尔范围内表现出优异的线性响应。成功区分七种混合的不同染料，突显了其在高精度单分子检测中的多功能性和有效性，为多通道单分子的平行检测提供了新的研究思路。相关研究成果以“Multiplexed Fluoro-electrochemical Single-molecule Counting Enabled by SiC Semiconducting Nanofilm”为题发表在Nano Letters上。南方科技大学2022级博士生贺海涵为第一作者，郝瑞副教授为通讯作者。
图1. 实验装置示意图以及SiC纳米薄膜的表征。作者首先在ITO表面通过磁控溅射制备40nm的SiC纳米薄膜，SiC纳米薄膜表面可以与大气中的H2O和O2相互作用，形成HxSiyOz化合物结构（图1C），在还原和氧化过程中，该硅化合物表面分别释放氢氧根离子或质子，起到调控局部pH的效果，进一步起到调控染料分子荧光开关的作用。
图2. 不同荧光染料（Cy3，ATTO 565，Alexa Fluor 546）在电化学调控下的机理以及原位电化学荧光光谱。通过循环伏安扫描，作者观察到不同结构的荧光分子在不同电位下的电化学响应。如图2A所示，单个Cy3分子在−1V时表现为“on”状态并显示出强荧光，ATTO 565分子处于“off”状态未显示荧光，而Alexa Fluor 546分子处于“weak”状态并显示出弱的荧光。当电位增加到1.6V时，ATTO 565和Alexa Fluor 546都转变为“on”状态， Cy3仍保持在“on”状态。随着电位的进一步升高，所有染料的荧光逐渐减弱，在3V时达到“off”状态。荧光染料的开关机理与其结构相关，主要分为以ATTO 565为代表的2-羧基罗丹明类染料和Cy3为代表的花菁类染料。其中ATTO 565在低电位下发生分子内螺环化反应，螺环化破坏了π共轭体系，从而关闭了荧光。随着电位增加，局部质子浓度迅速增加，导致螺环打开并恢复荧光。花菁类染料则不受此过程影响。在更高的氧化电位下，包括2-羧基罗丹明类和花菁类荧光染料在内的所有荧光染料都会失去电子。其中，Alexa Fluor 546也属于2-羧基罗丹明类染料，但是其在螺环化显示出弱的荧光，其独特的反应可能是由于其分子结构区别于其他2-羧基罗丹明染料。
图3. 单分子水平下的荧光-电化学响应以及线性动态范围的收集接下来，作者进一步研究了单分子水平下染料的荧光-电化学响应。对Cy3、ATTO 565和Alexa Fluor 546（图3A–3C），随机选择了五个单分子并分别进行了研究（图3D–3F），记录了每个单分子染料的荧光-电化学响应。结果表明，荧光-电化学的变化在所有单分子染料中都显著可控且一致。类似的电化学响应也在单个Cy2、Alexa Fluor 488、Cy5和Si-rhodamine分子中进行了研究。为了评估这种方法的准确性，作者对七种染料的进行了线性范围的收集。Cy3和ATTO 565在1-100 pmol/L的范围内表现出线性动态范围，Alexa Fluor 546在1-50 pmol/L的范围内表现出线性动态范围（见图3G）。检测限的确定依赖于对单分子数量的计数。此外，Cy2、Alexa Fluor 488、Cy5和Si-rhodamine同样在1-100 pmol/L的范围内表现出线性动态范围。
图4. 七种随机混合的不同染料的识别和区分。如图4所示，作者对七种染料进行随机混合。采用488、561和640 nm波长的激光，间隔50 ms交替照射。图4B显示了不同电位下七种染料的响应，清晰地辨别了每种分子对应的具体目标染料。在单次测试中，作者成功识别出了一个Cy2，一个Alexa Fluor 488，两个Cy3，两个ATTO 565，十个Alexa Fluor 546，一个Cy5和四个Si-rhodamine分子（图4C–4E）。作者观察到，不同荧光染料在“on”或“off”状态下略有不同，原因是它们的pKa值不同。例如，Alexa Fluor 488（488 nm通道）的起始点明显早于ATTO 565（561 nm通道），因此，即使在不分开荧光通道的情况下，也容易在单分子水平上区分它们。在这项研究中，作者开发了一种新的荧光-电化学的定量成像方法，用于并行检测单分子。通过SiC纳米膜修饰的ITO电极能够在不同电位范围内调控质子/电子转移。在较低电位范围内，进行表面pH调节，从而实现2-羧基罗丹明类染料的荧光开关，在更高电位下，电子转移使所有染料的荧光关闭，从而进一步实现准确的单分子计数。该方法在所有调控的染料中有良好的可控性和一致性，实现了皮摩尔级别的动态监测范围。通过利用三种激光通道能实现同时检测和区分七种不同的荧光染料。值得注意的是，作者使用的所有染料均为商业可用。随着定制荧光染料的开发，更多用于单分子检测的染料可以被开发，其多重检测潜力可以得到扩展。此外，这种表面pH调节机制同样具有广泛的实际应用前景，例如促进表面合成、分子自组装和生物传感器的制备等。
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