给大家推荐一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，文章标题是Design and Evaluation of a Cyclobutane Diazirine Alkyne Tag for Photoaffinity Labeling in Cells。其通讯作者是哈佛大学化学与化学生物学系的Christina M. Woo。课题组将小分子和蛋白质的合理设计与化学蛋白质组学技术相结合，开展在化学蛋白质组学、O-GlcNAc修饰和E3连接酶方面的研究。在本文中，作者开发了一种新型光亲和标签——环丁烷二吖啶炔基标签（PALBOX），用于细胞的光亲和标记。

光亲和标记（PAL）是研究生物分子相互作用的有效方法，PAL探针本身的设计也会影响实验产生的蛋白质谱。minimalist探针（Min探针）是目前广泛使用的PAL探针，是由反应基团、双吖丙啶和炔基组成的紧凑结构。但是，其光解过程中的重氮中间体表现出pH依赖性标记。为了解决这一问题，同时保持小尺寸标签的优势，作者开发了一种新的PAL标签——PALBOX，通过将双吖丙啶嵌入环丁烷中，减少了脱靶标记，并且不表现出pH依赖性。

图1. PALBOX的设计

首先作者从两个角度出发来设计新的探针。一方面，将其异构化限制为反应性重氮物质，另一方面，降低1,2-H迁移速率以减少烯烃副产物，作者假设这两者都可以通过使用应变环来缓解（图2a）。为了验证上述假设，作者在D2O中测试了一系列氮杂环光解产物，结果发现，二吖丙啶取代的氮杂环丁烷在光解时不产生烯烃或其他重排产物，但后续形成的盐酸盐会发生重排使产率下降（图2b）。随后，作者使用醋酸对探针进行测试，结果发现没有副产物的形成（图2c），表明二吖啶取代的四元环可能比无环二吖啶具有更小的pH依赖的标记偏差。基于这一结果，作者设计了如图2d所示的初代探针。但该探针反应基团设计有限，且具有手性，可能会使PAL探针的开发和分析复杂化。结合了一系列衍生化策略，作者开发了具有更多反应选择、无手性的PAL探针——PALBOX（图2f-g）。此外，通过计算发现（图2e），PALBOX形成的重氮中间体，能更快地转化为卡宾，其在溶液中的半衰期也更低。

图2. PALBOX的合成思路与发展

接着，作者评估了PALBOX与氨基酸的反应性。作者将BipBox与N-乙酰基，O-甲基保护氨基酸孵育，HPLC-MS结果发现，与半胱氨酸的反应性最高。但是，谷氨酸和天冬氨酸是第二和第三大反应性的氨基酸，表明环丁烷二吖啶重氮异构体可能仍在形成，并与酸性氨基酸选择性反应。

为了评估PALBOX在过量水存在下与有机酸反应的倾向，作者研究了BipBox和BipMin在50%乙腈/水中的光解，BipBox仅存在与Cys和Asp的痕量（∼0.5%）反应产物，BipMin则产生了5%至20%的产物（图3b）。随后，作者测试了PALBOX对蛋白质标记的pH依赖性（图3c）。结果发现，pH从5到8，Min的标记降低了近50%，Box的标记则不依赖于pH（图3d）。另外，BipMin会被环辛炔通过环加成反应捕获，BipBox则不会（图S7，未展示）。

图3. PALBOX的体外反应性

然后，作者在细胞中对PALBOX的标记能力进行了评估。作者将各种Min探针和Box探针在HEK293T细胞中进行了图4a所示的实验。与Min探针相比，Box探针整体的标记率较低，表明Box探针的背景标记更少。

通过定量蛋白质组学，作者也比较了BipBox和BipMin、JNBox和JNMin两组探针产生的相对标记谱。结果发现，Min探针对“背景组”蛋白质的标记程度高于Box探针，表明Box探针的脱靶比Min探针少（图4c）。

之后，作者测试了这些PAL探针标记和富集细胞中已知结合伴侣的能力。JQ1Min和JQ1Box都表现出对BRD4（BD2）的剂量依赖性富集，但JQ1Min中观察到对脱靶的VDAC1和vimentin的剂量依赖性富集。

图4. 使用PAL探针进行全蛋白质组细胞标记和靶标富集

最后，作者测试了PALBOX是否可用于分析小分子-蛋白质相互作用。将LenMin和LenBox分别与CRBN的沙利度胺结合结构域（CULT）孵育（图5a），结果发现，在相似浓度下，LenMin的相对标记比LenBox的相对标记高约五倍，与图4g中的结果一致。于是，作者采取图5b中的策略，鉴定出了图5c中的标记区域，与此前研究中由LenMin标记的区域相同。这些结果表明，Box探针与Min探针一样，可用于结合位点的鉴定，以生成相互作用的模型。

图5. 来那度胺的PALBOX探针（LenBox）与CULT的结合位点分析

总的来说，作者开发了一种新型三功能PAL标签——PALBOX，该探针的合成非常简单，与线性的烷基双吖丙啶相比，环丁烷双吖丙啶的标记不具有pH依赖性，且反应速度更快。然而，PALBOX探针并不是适用于所有标记实验。虽然它提高了标记特异性，但其整体信号降低，对于需要最大化标记信号的实验，Min探针可能是更好的选择。

文章作者：CXY

DOI：10.1021/jacs.2c08257

责任编辑：LD