近日，芝加哥大学Bryan Dickinson教授课题组博士研究生、王初课题组本科毕业生蓝童与合作者在J. Am. Chem. Soc.上发表文章“Discovery of Thioether-Cyclized Macrocyclic Covalent Inhibitors by mRNA Display”。本文报导了一种新型的mRNA展示技术，以筛选靶蛋白的共价环肽抑制剂，以下是作者的解读。
如何高效率地鉴定强效且具有高选择性的共价配体/抑制剂对于基础研究以及药物研发领域来说一直是一个重要问题。Bryan Dickinson课题组对棕榈酰化转移酶的小分子共价抑制剂开发做了一系列工作，然而我们发现基于已有的小分子共价抑制剂的优化很难有效提升抑制剂的效力，而我们也没有找到对棕榈酰化转移酶具有抑制活性的新型小分子骨架。这一挑战启发了我们对于基于非小分子骨架的共价抑制剂，特别是高效快速鉴定这些抑制剂方法的探索。我们最终将目光锁定在环肽上——它们固有的多肽类性质以及环化导致的受限构象使它们可以实现高效且高特异性地以非共价相互作用的形式靶向目标蛋白。同等重要的是，各种展示技术的发展使得通过高通量选择的方式快速鉴定需要的非共价环肽配体成为可能。这些性质使得环肽可以作为基本骨架，通过在展示技术中的环肽文库上安装共价弹头，实现快速鉴定共价靶向目标蛋白的配体/抑制剂的目的。Matthew Bogyo组提出了利用噬菌体展示直接鉴定针对半胱氨酸残基和丝氨酸残基的共价环肽的技术平台。他们设计了双功能探针—二氯丙酮-乙烯基磺酮(DCA-VS)—并使用了经典的建库策略（在噬菌体G3P的N端展示两端为半胱氨酸残基，中间为随机序列的短肽）， 使得在DCA与两个半胱氨酸残基反应形成环化结构的同时引入乙烯基磺酮这一反应性相对较弱的半胱氨酸共价弹头[1]。Jianmin Gao, Ratmir Derda等课题组的相关的后续工作都证明了利用高通量展示平台直接鉴定具有不同结构以及不同靶向残基的共价环肽配体或共价抑制剂的可行性 [2,3]。近年来由诺奖得主Jack Szostack课题组发明的mRNA展示技术的发展（如Hiroaki Suga课题组的RaPID技术）表明了利用超大规模的无偏随机文库（～10^12-10^14序列/文库）通过筛选直接鉴定强效非共价环肽配体的潜力 [4,5]。Albert Bowers课题组通过在文库中插入脱氢丙氨酸作为亲电共价弹头，将mRNA展示技术扩展到强效共价环肽配体的鉴定上[6]。然而目前为止，将mRNA展示技术应用于共价配体的技术平台依然非常有限。在这项工作当中，我们希望将可以同时引入环化以及共价弹头的化学探针和mRNA展示技术联用，实现直接筛选共价环肽抑制剂的目的。我们认为具有超大文库规模的mRNA展示技术有潜力直接鉴定到针对特定半胱氨酸残基的强效共价抑制剂。并且，我们认为利用化学探针的方式使得我们可以通过改造探针结构来靶向生物体系内各种不同的反应基团，有望进一步扩大这一方法的应用前景。我们认为实现高效短肽文库功能化是利用mRNA展示实现强效共价配体筛选的重要前提条件，因此，我们将Matthew Bogyo组的二氯丙酮-乙烯基磺酮(DCA-VS)探针改进成具有更强环化能力的二溴丙酮-乙烯基磺酮(DBA-VS)，在确定这一探针在单一多肽上可以快速单一地形成我们需要的环化产物之后，我们利用TEV酶切介导的凝胶阻滞实验以及硫醇-生物素富集实验证实了DBA-VS探针在30分钟内高效功能化mRNA展示文库（环化以及靶向巯基共价弹头安装）的能力。为了测试利用DBA-VS实现的共价mRNA展示平台，我们进一步将优化过后的共价mRNA展示流程应用于半胱氨酸水解酶TEV酶（一个经典的但是没有强效小分子抑制剂的模式蛋白）共价抑制剂的鉴定上。我们最终选用了NNK编码的随机文库结合使用文库C端的HA标签进行纯化，在保证文库的大规模及全面性的同时确保只有正确翻译预设序列的文库可以与TEV酶接触。为了排除共价标记非活性位点的共价抑制剂，在利用固定的TEV酶进行选择时我们加入过量未被固定的失活TEV酶C151A突变体，以此富集在动力学上更倾向于和TEV酶活性中心C151结合的共价环肽配体。最终我们通过筛选结合使用alphafold预测得到了目前为止最强效的TEV酶共价抑制剂cTEV6-2。cTEV6-2具有NGS结果中最普遍出现的-EPLCIWGC-核心序列。我们进一步证实这一分子通过共价靶向TEV酶活性位点C151发挥效能，并且在HEK293T细胞裂解液中具有很小的脱靶效应。总而言之，这项工作展示了一个可以与化学探针适配的共价mRNA展示流程，并在模式蛋白TEV酶上成功实现了强效共价环肽抑制剂的筛选。我们希望未来这一技术可以应用于鉴定靶向其他有重要功能的半胱氨酸残基的共价环肽抑制剂。同时，我们也希望这一平台可以结合不同的靶向策略，更多的应用于不同的目标分子，从而更全面地评估这一技术平台的适用性。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.4c07851[1] Chen, S. et al. Identification of highly selective covalent inhibitors by phage display.Nat Biotechnol 39, 490-498 (2021).[2] Zheng, M. et al. Lysine-Targeted Reversible Covalent Ligand Discovery for Proteins via Phage Display. J Am Chem Soc 144, 15885-15893 (2022)[3] Ekanayake, A. I. et al.Genetically Encoded Fragment-Based Discovery from Phage-Displayed Macrocyclic Libraries with Genetically Encoded Unnatural Pharmacophores. J Am Chem Soc 143, 5497-5507 (2021)[4] Yamagishi, Y. et al. Natural product-like macrocyclic N-methyl-peptide inhibitors against a ubiquitin ligase uncovered from a ribosome-expressed de novo library. Chem Biol 18, 1562-1570 (2011)[5] Schlippe, Y. V., Hartman, M. C., Josephson, K. & Szostak, J. W. In vitro selection of highly modified cyclic peptides that act as tight binding inhibitors. J Am Chem Soc 134, 10469-10477 (2012)[6] Iskandar, S. E. et al.Identification of Covalent Cyclic Peptide Inhibitors in mRNA Display. J Am Chem Soc 145, 15065-15070 (2023)
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