为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，文章的题目是“Standard-Free Absolute Quantitation of Antibody Deamidation Degradation and Host Cell Proteins by Coulometric Mass Spectrometry”，通讯作者是来自新泽西理工学院的Hao Chen和詹森公司的Harsha P. Gunawardena，Chen老师的实验室主要进行与质谱相关的电化学分析化学等研究。基于质谱的蛋白丰度定量非常重要。基于同位素标记的如SILAC、ICAT等方法具有成本较高，制样较复杂的缺点。Label-free的无标绝对定量允许对大范围蛋白质组进行定量，但由于不同肽的电离效率不同，准确度较差。作者团队近期开发了一种叫做库伦质谱(coulometric mass spectrometry, CMS)的无标定量方法，其原理是电化学活泼的肽段，如包含酪氨酸或者色氨酸残基的肽，发生电化学氧化时会产生电流，通过计算电流对时间的积分即可得到总电荷量Q，再通过法拉第定律就可以计算氧化肽的摩尔数。同时电化学活性肽被氧化后，其MS强度会降低，氧化前后MS的强度变化可以计算氧化产率Δi，即有多少肽发生了电化学氧化。最后将氧化肽的摩尔数和氧化产率结合就可以计算出该肽段的总丰度。在作者之前的工作已经实现了使用CMS对单个蛋白进行定量，还没有进行到复杂的混合物中，在本文中作者便尝试对混合物中低丰度蛋白应用此方法。在本文作者关注的实际问题是对单克隆抗体mAb药物中宿主细胞蛋白HCP的快速定量，和对mAb的Asn脱酰胺修饰的定量。HCP是mAb生产过程中的主要杂质，其会影响产品的质量和使用安全；Asn脱酰胺化则是Asn脱去胺基后，经过一个琥珀酰亚胺中间体最终形成天冬氨酸或β-天冬氨酸，对蛋白的稳定性具有重要影响，目前还没有对琥珀酰亚胺中间体的绝对定量工作被报道。作者首先尝试使用CMS在一次运行中对3个蛋白进行同时定量，这3个蛋白各自含有一个带有酪氨酸/色氨酸的“代表肽(surrogate peptide)”。作者在一次运行中分别对它们进行定量，并使用同位素标准肽作为对比，结果显示CMS的结果与同位素的结果误差不超过5%；同时CMS计算的前体蛋白量与实际加入的蛋白量之间的误差在25%以内，体现了CMS优秀的肽定量准确性和可以接受的蛋白定量准确性。接着作者将CMS用于定量mAb中少量的HCP杂质——PLBL2。为了进一步提高PLBL2的信号，作者首先在非变形条件下使用胰酶消化样品，mAb具有一定的胰酶抗性，因此可以被蛋白沉淀除去。结果显示CMS的最终定量结果与同位素加入法之间的误差仅为5%左右。最后作者将CMS应用在对NISTmAb N318脱酰胺修饰的定量，由于N318所处的肽段正好包含一个色氨酸，因此作者成功对不同形式的N318所处肽进行了定量。综上所述，在本文中作者将之前开发的库伦质谱CMS进一步推广到了相对复杂的混合物体系中，成功在一次运行中对多个蛋白或低丰度蛋白(500 ppm)进行了定量，结果显示与同位素加入法相比，CMS也具有较好的定量准确性。
本文作者：LYP
责任编辑：Guo ZH
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.2c02709
文章引用：DOI：10.1021/acs.analchem.2c02709
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