分享一篇发表在PNAS上的文章：Widespread hydroxylation of unstructured lysine-rich protein domains by JMJD6，通讯作者是牛津大学的Peter J. Ratcliffe教授和Francis Crick研究所的Matthew E. Cockman，前者课题组目前的主要研究方向是蛋白羟基化修饰相关的信号传导机制。这篇文章作者发现JMJD6可催化蛋白上富含赖氨酸区域上的赖氨酸羟基化修饰，对底物进行了鉴定。

      蛋白上的羟基化修饰是一种重要的翻译后修饰，经典的缺氧诱导因子HIF上脯氨酸的羟基化修饰能够帮助细胞感受缺氧条件，进而启动下游的转录过程。羟基化修饰除发生在脯氨酸上以外，近年来也被报道存在于赖氨酸，天冬氨酸，组氨酸等残基上，催化这一修饰生成的酶除依赖于α-酮戊二酸的双加氧酶外，还包括JMJD家族蛋白，其中JMJD6被报道参与了多种重要的生物学过程，但确切的底物及分子机制目前仍然未知。

      为了从蛋白质组中发现羟基化修饰的底物，作者通过深度分级的蛋白质组学从1260万张谱图中发现BRD4蛋白的520到537位上存在着1个/2个羟基化修饰。2019年曾有文献报道BRD4的536位的脯氨酸能在PHD2蛋白的催化下发生羟基化修饰，但作者的搜库结果给出的打分结果倾向于认为修饰发生在537位。作者在重复前人实验时发现敲除PHD1-3蛋白后对鉴定到的羟基化修饰的水平并无影响，而敲除已知的BRD4相互作用蛋白JMJD6后羟基化修饰完全消失，说明JMJD6才是真正催化BRD4上羟基化修饰的酶。

      随后为了确定羟基化修饰发生在哪个位点上，考虑到BRD4的C端富含赖氨酸，传统的trypsin酶切手段无法得到适合质谱检测的肽段，作者发现换用Asp-N进行酶切后能够得到长度适宜的肽段并鉴定到了BRD4上的5个羟基化修饰位点。为了进一步提高对富含赖氨酸区域的覆盖度，作者将流程优化为通过BRD4的配体进行富集，再通过丙酸酐对赖氨酸进行衍生，以中和正电荷并引起trypsin的漏切，从而得到长度适中的肽段。最终作者成功鉴定到BRD4上的19个羟基化修饰位点，其中14个位于富含赖氨酸的区域中。对这些位点上羟基化修饰的修饰率进行分析他们发现，其中部分位点的修饰率接近100%。

      考虑到在BRD4的富含Lys结构域中作者鉴定到大量的赖氨酸羟基化修饰，作者随后希望在蛋白质组中鉴定到更多的JMJD6的底物，他们通过二甲基乙二酰氨基乙酸(DMOG)作为α-酮戊二酸的类似物来增强JMJD6与底物的结合，进而pull-down出JMJD6的底物蛋白，通过质谱鉴定他们找到了32个蛋白上的108个羟基化修饰位点。另一方面他们利用JMJD6上催化区域的肽段直接进行pull-down，共鉴定到26个蛋白上的39个修饰位点，同样的，部分修饰位点有着极高的修饰率。

      总之，这篇文章发现JMJD6可催化蛋白上富含赖氨酸区域上的赖氨酸羟基化修饰，并鉴定到了大量的修饰底物。

本文作者：LDY

责任编辑：WXH

全文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2201483119

文章引用：https://doi.org/10.1073/pnas.2201483119